張譯元，郭延華，王聰慧，唐 紅，南海艷，王立民，周 平

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆石河子 832000；2.陜西西安市閻良區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，西安 710000)

0 引 言

【研究意義】在綿羊的遺傳育種與品種改良進程中，快速、定向選育具有某些優(yōu)質(zhì)性狀的新品種或品系，是綿羊種質(zhì)資源保護和綿羊生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。以往轉(zhuǎn)基因技術(shù)克隆成功率低，且獲得的轉(zhuǎn)基因后代個體往往存在繁殖障礙。誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPS)。iPS細胞是一類具有無限增殖能力[1]和多向分化潛能[2]的細胞類群，可塑性強，能夠高效實現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入、敲除和改造。iPS最初是由日本科學(xué)家山中伸彌(Takahashi, Yamanaka, 2006)通過病毒載體將OCT4(Octamer binding transcription factor 4)、SOX2(SRY(sex determining region Y)-box2)、KLF4(Kruppel-like factor 4)、c-Myc(Myelocytomatosis oncogene)這四個轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細胞中，使之重編程構(gòu)建出來的。如果把iPS細胞誘導(dǎo)技術(shù)和基因打靶技術(shù)、細胞核移植技術(shù)、嵌合體技術(shù)相結(jié)合，對綿羊的轉(zhuǎn)基因育種和生產(chǎn)意義重大?！厩叭搜芯窟M展】迄今為止，有關(guān)人(Homosapiens)[3,4]、小鼠(Musmusculus)[5]、大鼠(Rattusnorvegicus)[6]、猴子(Macacamulatta)[7]、豬(Susscrofa)[8]、綿羊(Ovisaries)[9]的iPS細胞系構(gòu)建均已有研究報道。2006年Takahashi和Yamanaka將小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)為多能干細胞，并通過四倍體囊胚嵌合技術(shù)，進一步證實小鼠iPS細胞能夠發(fā)育成完整的個體[10]。2007年Thomson和Yamanaka兩實驗室又分別將人體皮膚成纖維細胞誘導(dǎo)成iPS細胞[3,4]。在綿羊iPS細胞系研究方面，Bao等[5]和Liu等[11]先后獲得了能形成畸胎瘤和擬胚體并具有正常核型的綿羊iPS細胞系。Liu等[11]將綿羊iPS細胞注射到二倍體或四倍體胚胎中，形成了內(nèi)細胞團的部分結(jié)構(gòu)，但未形成嵌合體。Sartori等[12]將Oct4、Sox2、 Klf4、c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子(OSKM)轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細胞，形成了具有正常核型的iPS細胞，并形成畸胎瘤和擬胚體；將獲得的iPS細胞植入到胚胎后，生出了嵌合體小羊?！颈狙芯壳腥朦c】綿羊iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)取得了階段性進展，但綿羊iPSCs形態(tài)特征及鑒定方法并無統(tǒng)一的標準，誘導(dǎo)方法及培養(yǎng)條件也形色各異。目前，綿羊iPS細胞的誘導(dǎo)基本采用病毒載體轉(zhuǎn)染的方式，存在一定安全風(fēng)險；其次，由于物種不同，多能性基因、信號通路也會不同[13]，重編程因子的選擇對iPS細胞的誘導(dǎo)效率會造成一定影響。因此，如何提高誘導(dǎo)效率、降低致癌率和抑制iPSCs的分化是目前綿羊iPSCs急需解決的問題。試驗以綿羊成纖維細胞為基礎(chǔ)材料，通過電轉(zhuǎn)，導(dǎo)入五種轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4、l-Myc、Lin28，構(gòu)建綿羊iPS細胞系；在此基礎(chǔ)上結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)重點對不同誘導(dǎo)時期的iPS細胞進行高通量測序?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析相關(guān)因子在誘導(dǎo)不同階段的表達變化，研究差異基因所涉及的信號通路，選擇更為適合綿羊iPS細胞誘導(dǎo)的重編程因子，為豐富綿羊iPS建系機制提供一定的基礎(chǔ)資料，為綿羊轉(zhuǎn)基因育種及動物種質(zhì)資源保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗動物來自新疆農(nóng)墾科學(xué)院轉(zhuǎn)基因種羊場。

重組質(zhì)粒：PCXLE-Hoct3/4-shp53(Oct3/4)、PCXLE-hSK(Sox2, Klf4)、PCXLE-hul(l-Myc, lin28)等，均購自美國Addgene公司，Lonza 4D-Nucleofector電轉(zhuǎn)儀與P2電轉(zhuǎn)染試劑盒購自德國LONZA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TAKARA公司；堿性磷酸酶試劑盒、免疫熒光染色所用抗體購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，DAPI 染料購自ROCHE公司。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊iPS細胞的誘導(dǎo)及培養(yǎng)

離心收集對數(shù)期的綿羊成纖維細胞，細胞密度至5×106mL-1；添加20 μL電轉(zhuǎn)液和重組質(zhì)粒，重懸細胞，選擇EH-100程序進行電轉(zhuǎn)；靜置10 min，加入80 μL細胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，混勻后全部移至培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)9～12 h后更換培養(yǎng)液，36 h時觀察細胞的貼壁情況。3 d后換成iPS細胞培養(yǎng)液(20% KSR、0.1 mol/L β-巰基乙醇、0.02 mol/L谷氨酰胺、0.01 mol/L非必需氨基酸(NEAA)、0.005 g/L b FGF的Knockout DMEM培養(yǎng)基)，培養(yǎng)液中添加終濃度為0.05 mg/L VC，隔天換液。

1.2.2 堿性磷酸酶(AP)染色

用4%(M/V)多聚甲醛固定iPS克隆樣細胞，15 min后棄固定液，PBS洗滌2次，滴加染色液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，待染色液掩蓋孔底，室溫避光15～20 min，棄染色液，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀測染色結(jié)果。

1.2.3 免疫熒光染色

4%(W/V)多聚甲醛固定細胞20 min，1×PBS浸洗2次，無水乙醇浸泡2次，每次20 min；1×PBS浸洗2次，吸水紙吸干PBS，在細胞上滴加5%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量稀釋好的一抗，4℃過夜孵育，PBST浸洗細胞3次，每次5 min；吸水紙吸干細胞上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，37℃孵育1 h，PBST浸洗細胞3次，每次5 min。復(fù)染核：滴加1 μg/mL的DAPI避光孵育5 min， PBST 5 min×3次洗去多余DAPI，吸水紙吸去細胞上殘余液體，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測

提取細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以綿羊GAPDH基因(F: ACGGGAAGCTCACTGGCATGG R: GCCAGCCCCAGCATCGAAG)為靶標，對Oct4(F: TACACTGTACTCTTCGGTCCCATT R: AGCATCATTGAACTTCACCTTCCC)、Sox2(F:TACGGTAGGAGCTTTGCAGAAAGT R: TGCACGTTTGCAACTGTCCTAAAT)、Nanog(F:CAAGTATTTCAGTTCCCAGCAGCA R: TGCACGTTTGCAACTGTCCTAAAT)基因使用LightCycler? 480實時熒光定量PCR儀(Roche公司)進行熒光定量PCR檢測，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)進行45個循環(huán)，65℃再延伸1 min并在這一過程中進行熔解曲線分析?；虻南鄬Ρ磉_量采用2-△△Ct法計算，使用GraphPad Prism 5進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序

分別收集誘導(dǎo)0、10、20和30 d的細胞，由北京華諾生物科技有限公司提供測序服務(wù)，使用Illumina HiseqTM2000平臺測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序所得數(shù)據(jù)稱之為raw reads，將其測序接頭序列末端質(zhì)量低于20 bp的堿基、含N比率大于5%和質(zhì)量較低的reads去除，去除后的數(shù)據(jù)稱為clean reads。對clean reads使用Trinity軟件進行De novo組裝得到Unigene，然后使用Tgicl軟件對這些序列進行同源轉(zhuǎn)錄本聚類，得到最終的Unigene。之后將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫NR、Swiss-Prot、KEGG和COG作blastx比對(evalue<0.000 01)，獲得相應(yīng)的注釋信息。針對Unigene表達量的計算，使用FPKM法(Fragments Per kb per Million fragments)。以FDR≤ 0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因定義為差異表達基因，將所得到的差異基因GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫富集進行注釋與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

該細胞排列緊密，呈圓形或不規(guī)則集落狀生長，形似鳥巢，在集落邊緣可見部分分化細胞。堿性磷酸酶染色(AP)呈強陽性。圖1

圖1 A：綿羊成纖維細胞；B：綿羊iPSC克??；C:綿羊iPSC克隆堿性磷酸酶染色
Fig.1 A: sheep fibroblast cells; B: OiPSC colony ; C: AP staining

2.2 免疫熒光檢測

對誘導(dǎo)培養(yǎng)的綿羊iPS細胞進行細胞免疫熒光檢測，結(jié)果顯示克隆多能性蛋白SOX2、OCT4和表面標記SSEA-1呈陽性。圖2

圖2 綿羊iPS細胞蛋白免疫熒光檢測
Fig.2 The immune fluorescence identification of OiPSC

2.3 實時熒光定量RT-PCR

隨機選取4個綿羊iPS細胞，以綿羊成纖維細胞為陰性對照，實時熒光定量PCR檢測OCT4、SOX2、Nanog的表達水平。結(jié)果顯示：綿羊iPS細胞中多能性基因的表達水平極顯著高于成纖維細胞(P< 0.01)。圖3

圖3 OiPSCs的Oct4、Sox2、Nanog基因的qPCR檢測
Fig.3 The quantitative PCR analysis of Oct4, Sox2 and Nanog in OiPSCs

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序

2.4.1 不同誘導(dǎo)時期細胞RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接

統(tǒng)計誘導(dǎo)0、10、20和30 d Unigenes數(shù)量，分別獲得55 795、47 416、48 069和48 927條Unigenes序列。

2.4.2 不同誘導(dǎo)時期差異基因的表達

不同誘導(dǎo)時期差異基因的表達水平(圖4A-B)。以誘導(dǎo)0 d的細胞作為對照，誘導(dǎo)30 d的細胞共獲得9 465個差異表達基因，其中上調(diào)基因6 987個，下調(diào)基因2 478個。利用Blast2GO軟件，按照參與的細胞組分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)和生物過程(Biological Process)(圖4C)對30和0 d的差異基因進行分類注釋。經(jīng)比對共有5 374個差異基因?qū)Ρ鹊紾O數(shù)據(jù)上。在參與的生物學(xué)過程中，細胞過程(cellular process)所占比例最多，占12.6%，其次為單體過程(single-organism process)和代謝過程(metabolic process)，分別占10.5%和10.4%；在細胞成分(cell component)分類中，細胞組分(cell part)所占比例最多，占18.7%，其次是細胞(cell)和細胞器(organelle)，分別占18.6%和15.9%；在分子功能(molecular function)分類中，分子綁定(binding)所占比例最高，占49.3%，其次是催化活性(catalytic activity)和酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)，分別占25.6%和4.5%。圖4

圖4 30和0 d細胞中基因差異表達
Fig.4 Different UniGene expression profiles between 30 cell and 0 d cell

2.4.3 部分干性相關(guān)基因誘導(dǎo)0和30 d表達量差異性比較

利用Cufflinks軟件，計算每個Unigene在各個樣本中的表達量FPKM值，F(xiàn)PKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因差異表達量可直接用于比較不同樣本間的基因表達差異。l-Myc、Sox2、Oct4在綿羊成纖維細胞重編程過程中基因表達量均呈上調(diào)趨勢，其中，l-myc和Sox2基因表達量差異性顯著，Oct4基因差異不顯著。圖5

2.4.4 誘導(dǎo)30和0 d細胞差異表達基因的KEGG富集

將已注釋的差異表達基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共有5 773個基因比對到KEGG數(shù)據(jù)庫，共涉及到259條通路，其中富集通路最多的是剪接體通路，其次是卵母細胞成熟分裂通路和P53信號通路，說明這三條通路在綿羊多潛能干細胞誘導(dǎo)過程中最活躍。表1

圖5 RNA-Seq分析綿羊成纖維細胞重編程的基因表達
Fig.5 Gene analyses in reprogramming of Ovis fibroblasts using RNA-seq表1 差異表達基因KEGG代謝途徑分類
Table 1 KEGG classification of differentially expressed genes

序號NO.代謝通路Pathway差異基因的數(shù)量Count占差異基因通路注釋比例(%)通路IDPathway IDP值P value1剪接體1662.88Ko030407.726 391e-142卵母細胞成熟分裂881.52Ko041148.033 686e-133P53信號通路741.28Ko041155.583 583e-054同源重組300.52Ko034401.572 978e-055血管內(nèi)皮生長因子信號通路480.83Ko043700.000 101 272 8

3 討 論

誘導(dǎo)性多能干細胞是經(jīng)體細胞重編程形成的，但重編程的分子調(diào)控機制至今尚未完全清楚，尤其是在大動物的iPSCs的研究略有滯后。在綿羊iPSCs誘導(dǎo)技術(shù)方面最為成熟的是iPS細胞誘導(dǎo)分化成三胚層，并且能檢測到iPSCs的標記。Li等[14]成功將慢病毒介導(dǎo)的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四因子轉(zhuǎn)入綿羊成纖維細胞，培養(yǎng)14 d后出現(xiàn)類似人胚胎干細胞樣形態(tài)的克隆，經(jīng)堿性磷酸酶染色、畸胎瘤三胚層組織學(xué)鑒定均證明是干細胞。Bao等[5]將四環(huán)素誘導(dǎo)慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子，同時補充添加Nanog、Lin28、SV40 large T和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶hTERT轉(zhuǎn)染至胎羊成纖維細胞，用Knockout血清替代品(Knockout serum replacement, KSR)代替胎牛血清培養(yǎng)細胞，11～20 d出現(xiàn)克隆，形態(tài)類似小鼠胚胎干細胞，經(jīng)堿性磷酸酶染色，Oct4、 Sox2、 Nanog、SSEA-1、Tra1-60以及Tra-1-81這些標記物染色都為陽性。另有研究表明，盡管Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc這四個限定因子具有高度的保守性，但iPSCs的形態(tài)、增殖能力和相應(yīng)的分子機制存在種屬差異。譬如，人和小鼠的iPS細胞形態(tài)和自我更新的分子機制具有明顯的差異。與人和小鼠相比，綿羊iPSCs較難獲得[9]。一般認為，Oct3/4 和 Sox2 是誘導(dǎo)多能性所需的核心因子，而Klf4 和 c-Myc則能提高Oct3/4和Sox2的誘導(dǎo)效率[15]。Esteban等[16]認為，四因子誘導(dǎo)法中，去除c-Myc可獲得較好的iPS，建系成功率也顯著提高。Nakagawa等[17]研究表明，去除c-Myc誘導(dǎo)iPS細胞時，誘導(dǎo)時間較長且效率較低，但特異性強。這說明c-Myc的作用可能是促進細胞的增殖而不是細胞的重編程[18]。研究采用Oct4、Sox2、Klf4、l-Myc、lin28五因子誘導(dǎo)法，結(jié)果顯示，在其他條件一致的情況下，選擇質(zhì)粒濃度質(zhì)量比1∶1∶1時，更有利于形成AP+克隆[19]。常見的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法包含病毒載體法、脂質(zhì)體法和電轉(zhuǎn)法等，鑒于電轉(zhuǎn)保護劑既能降低細胞死亡率，又能提高電轉(zhuǎn)效率，試驗采取電轉(zhuǎn)法并且使用KSR代替胎牛血清培養(yǎng)綿羊iPS細胞，細胞傳代明顯增強，可傳至第4代。

細胞表面標記能有效識別和區(qū)分多能干細胞，是鑒定多能干細胞重要的工具。SSEAs作為一種表面標記物被廣泛用于監(jiān)測胚胎干細胞的多能性，它包括SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4。 Dattena等[20]報道，綿羊胚胎干細胞表達SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，Li等[14]研究顯示，綿羊iPSCs只表達Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-4，未表達SSEA-1和SSEA-3；而試驗顯示綿羊iPSCs只表達Sox2、Oct4、SSEA-1，部分轉(zhuǎn)染的基因表現(xiàn)沉默。這可能與不同實驗室采用的誘導(dǎo)方案及誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs重編程程度有關(guān)，也有可能是其他一些因素影響了細胞狀態(tài)，尚需進一步的試驗佐證。Chin等[21]通過比較不同代數(shù)人iPS細胞和人胚胎干細胞的基因表達圖譜，結(jié)果顯示，代數(shù)高的人iPS細胞(第54～61代)比代數(shù)低的人iPS細胞(第5～9代)更接近于胚胎干細胞。由此推測，持續(xù)培養(yǎng)的過程對完善iPS細胞重編程意義重大。從試驗實時熒光定量PCR檢測結(jié)果來看，綿羊iPS細胞中多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表達量均顯著增高，和RNA-Seq的結(jié)果相一致，初步證實了獲得的iPS細胞具有一定的多能性。

比較綿羊iPSCs和用于重編程的成纖維細胞之間基因的表達情況對于了解綿羊多能性干細胞誘導(dǎo)的分子過程是非常重要的。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為揭示研究動、植物基因表達及調(diào)控發(fā)揮了重要作用，尤其在側(cè)重了解動物發(fā)育某一方面的基因表達，挖掘差異表達基因備受關(guān)注[22]。研究利用高通量測序技術(shù)構(gòu)建了誘導(dǎo)0、10、20和30 d細胞的轉(zhuǎn)錄組文庫，獲得了大量基因信息。重點針對誘導(dǎo)30和0 d的陽性細胞測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，篩選到的差異表達基因顯著富集在卵母細胞成熟分裂、同源重組、P53信號通路等通路上。其中，顯著富集的P53信號通路參與細胞的生長調(diào)控過程。已有研究證實，P53基因的突變和刪除與一系列腫瘤相關(guān)聯(lián)；P53基因編碼的蛋白在細胞損傷的情況下可誘導(dǎo)激活下游的P21蛋白，觸發(fā)DNA修復(fù)和細胞凋亡，P53～P21蛋白通路能抑制干細胞的分化和增殖，因此，抑制P53基因的表達可提高重編程的效率[23]。研究表明，敲除P53蛋白的和ASF1A蛋白能夠提高綿羊腎臟細胞重編程的效率[24]。有趣的是，不同于成熟細胞中的低水平P53，這種蛋白在ESC和iPSCs中呈高豐度表達[25]。研究結(jié)果進一步證實了綿羊成纖維細胞在向著iPSC轉(zhuǎn)變。

4 結(jié) 論

利用電轉(zhuǎn)法將Oct4、Sox2、Klf4、l-Myc、Lin28五個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入至綿羊成纖維細胞中，經(jīng)AP染色、細胞免疫熒光及熒光定量PCR檢測，細胞均呈陽性，且表達Oct4、Sox2、SSEA-1等多種ES細胞的多能性標記基因；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得了大量的綿羊候選功能基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要涉及細胞組分、分子結(jié)合、細胞過程等諸多生理生化過程，同時參與多種信號通路，其中，P53信號通路顯著富集，且其在干細胞增殖方面起著非常重要的作用，獲得了綿羊誘導(dǎo)性多能干細胞。

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