王珊珊 陳 燕 劉 盾等

摘 要：目的：對地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）LS-1的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以提高發(fā)酵液中蛋白酶的產(chǎn)量。方法：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，分析培養(yǎng)基pH、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對其產(chǎn)酶能力的影響，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果：地衣芽孢桿菌LS-1在接種量4%，培養(yǎng)基初始pH12，培養(yǎng)溫度40℃，培養(yǎng)時間48h時酶活最高，為307.3U/mL。

關(guān)鍵詞：蛋白酶;地衣芽孢桿菌;發(fā)酵條件

中圖分類號 Q939.97 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2018）24-0022-3

Abstract：Objective：The fermentation conditions were optimized for improve protease yield of strain LS-1（Baclicus lincheniformis）.Methods：Strain LS-1 was used as the starting strain，and single factor test was performed from four aspects including medium pH，inoculating quantity，culture temperature and culture time to explore its fermenting conditions，then orthogonal experimengts were carried out to optimize its fermenting conditions.Results：The best fermenting conditions were summed up as follows： the inoculation quantity was 4%，medium pH was 12，culture temperature was at 40℃，and culture time was 48h.Under optimized conditions ，the protease activity was up to 307.3U/mL.

Key words：Protease;Baclicus lincheniformis;Fermentation condition

蛋白酶（proteases，proteinases），也稱為肽酶（peptidases），是能水解蛋白質(zhì)和多肽的一群酶類，它們可以催化蛋白質(zhì)或肽類的肽鍵降解，廣泛存在于動物、植物和微生物中，約占所有蛋白質(zhì)的2%。來源不同的蛋白酶，執(zhí)行的功能也不同，例如，胞內(nèi)蛋白酶與細胞的催化和調(diào)節(jié)作用有關(guān)，胞外分泌的蛋白酶則在降解氮源或其他能源底物中扮演了重要角色。蛋白酶是用途最廣泛的酶制劑之一，約占世界酶類銷售總額的60%，其在食品、醫(yī)藥、紡織、制革、洗滌劑、化妝品以及廢物處理等行業(yè)都有著較好的應(yīng)用前景[1]。

本實驗室從高溫酒曲中分離產(chǎn)蛋白酶菌株LS-1，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）。本研究擬以該菌株為研究對象，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，為該蛋白酶資源的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 地衣芽孢桿菌（Baclicus lincheniformis）LS-1，由本實驗室分離、保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器 試劑：酪蛋白、牛肉膏、瓊脂粉等均為生物純，北京奧博星;葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均為分析純，天津科密歐;酪氨酸，分析純，sigma進口分裝;Folin-酚試劑：上海國藥。儀器：上海精宏DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱;上海智誠ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器;德國艾本德5430R高速臺式冷凍離心機;上海躍進XMTD-204數(shù)顯式恒溫水浴鍋;上海儀電雷磁PHS-3CpH計;上海舜宇恒平MP2002電子天平;申安LDZX-50KBS高壓滅菌鍋;奧林巴斯CX23雙目光學顯微鏡;上海精科752N分光光度計。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：酵母膏2.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，K2HPO4·7H2O 3.5g，KH2PO4 1.5g，NaCl 2.5g，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶活力的測定[2]

1.2.1.1 酪氨酸標準曲線制作 配制10、20、30、40、50、60μg/mL的酪氨酸標準溶液，配制2%酪蛋白溶液;然后分別取上述溶液各1mL，各加0.55mol/L碳酸鈉溶液5mL、Folin-酚試劑溶液1mL，振蕩均勻，于40℃水浴中顯色20min，取出用分光光度計于680nm，不含酪氨酸的反應(yīng)體系為空白，分別測其吸光度，以吸光度A為縱坐標，酪氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.1.2 待測酶液蛋白酶活力測定 將2%酪蛋白溶液放入40℃恒溫水浴中，預熱5min;取1mL粗酶液加入2mL預熱好的酪蛋白溶液中混勻后放入40℃水浴中保溫10min后加入1mL10%TCA終止反應(yīng)，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO3 5mL，加入1mLFolin-酚試劑至40℃水浴顯色20min后于680nm下測定吸光值，以加熱滅活的酶液反應(yīng)體系為空白。酶活力單位定義：40℃下，每分鐘水解酪蛋白底物產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。計算公式：

蛋白酶活力（U/mL）=A×K×4÷10×n

式中：A：粗酶液平行實驗的OD值;K：吸光常數(shù);n：蛋白酶的液的稀釋倍數(shù);4：反應(yīng)試劑的總體積;10：反應(yīng)時間10min;所得結(jié)果表示至整數(shù)

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗 選擇培養(yǎng)基初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間為影響蛋白酶活性的主要因素，通過單因素試驗考察以上因素對LS-1產(chǎn)蛋白酶的影響。培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液在4℃，6000r離心10min取上清液測定酶活。（1）培養(yǎng)基初始pH：將發(fā)酵培養(yǎng)基以50mL的裝液量裝入到250mL三角瓶中，分別利用1.0M HCl溶液和1.0M NaOH溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH為4.0～11.0，每個pH做3個平行，121℃滅菌30min后，將種子液按照4%的接種量分別接入三角瓶內(nèi)，于搖床150r、37℃培養(yǎng)48h。（2）接種量：將發(fā)酵培養(yǎng)基以50mL的裝液量裝入到250mL三角瓶中，121℃滅菌30min后，將種子液分別按照2%、4%、6%、8%、10%的接種量分別接入三角瓶內(nèi)，每個接種量做3個平行，于搖床150r、37℃培養(yǎng)48h。（3）培養(yǎng)溫度：將發(fā)酵培養(yǎng)基以50mL的裝液量裝入到250mL三角瓶中，121℃滅菌30min后，將種子液按照4%的接種量分別接入三角瓶內(nèi)，于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃5個溫度搖床150r培養(yǎng)48h，每個溫度做3個平行。（4）培養(yǎng)時間：將發(fā)酵培養(yǎng)基以50mL的裝液量裝入到250mL三角瓶中，121℃滅菌30min后，將種子液按照4%的接種量分別接入三角瓶內(nèi)，于搖床150r、37℃分別培養(yǎng)12h、24h、48h、60h、72h，每個時間點做3個平行。

1.2.2.2 正交試驗 根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取對LS-1產(chǎn)酶影響較大的因素設(shè)計正交實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線 詳見圖1。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH對LS-1產(chǎn)酶的影響 由圖2可知，LS-1在堿性環(huán)境中產(chǎn)酶能力較高，當培養(yǎng)基初始pH為11時，其酶活可達362.2U/mL。

2.2.2 接種量對LS-1產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，LS-1所產(chǎn)蛋白酶的酶活在接種量為2%～10%無顯著性差異，說明接種量對產(chǎn)酶影響不大。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對LS-1產(chǎn)酶的影響 由圖4可知，LS-1在40℃培養(yǎng)時，蛋白酶酶活最高，為242.9U/mL;當培養(yǎng)溫度為50℃時酶活仍然較高，達238.2U/mL。說明LS-1在20～50℃時均能生長并產(chǎn)生蛋白酶，在40～50℃溫度范圍具有一定耐熱性。當培養(yǎng)溫度為60℃時酶活明顯下降，可能是溫度過高不適宜菌株生長或者是高溫下蛋白酶活力喪失所致。

2.2.4 培養(yǎng)時間對LS-1產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，LS-1產(chǎn)蛋白酶活力逐漸上升，48h時酶活最高為276.7U/mL;而當培養(yǎng)時間達到60h后，蛋白酶活力略有下降，可能是菌株生長進入衰退期，產(chǎn)蛋白酶能力有所下降。

2.3 正交實驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果比較分析得出，接種量對LS-1產(chǎn)蛋白酶活力無顯著影響，而培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、初始pH的影響較大，故設(shè)計L9（33）的正交實驗（見表1、表2）。由表2可知，對菌株LS-1產(chǎn)酶影響的主次順序為B（培養(yǎng)溫度）>A（培養(yǎng)時間）>C（初始pH），通過優(yōu)化得到的產(chǎn)酶最佳條件是A2B2C3，即培養(yǎng)基初始pH為12，40℃下培養(yǎng)48h，LS-1酶活最高，為307.3U/mL。

3 討論

中國濃香型白酒的生產(chǎn)采用固態(tài)發(fā)酵模式，在其發(fā)酵過程中存在豐富的微生物種群，其中分泌蛋白酶的微生物，能將物料中的蛋白質(zhì)分解成小分子有機物質(zhì)氨基酸，這些氨基酸會被微生物利用代謝，同時會提供豐富的前體物質(zhì)促進白酒中香味物質(zhì)的產(chǎn)生[3]。曾德勇[4]等在醬香型高溫大曲中篩出了高產(chǎn)蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。馬特[5]等在白酒窖泥中初篩出8株可產(chǎn)蛋白酶的菌株，復篩出3種高產(chǎn)蛋白酶的菌株分別為：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。王俊英[6]等使用牛奶平板從酒曲中分離出6株有明顯水解圈的產(chǎn)蛋白酶的菌株，其中直徑比最大的為芽孢桿菌，最適產(chǎn)酶溫度為40℃。

本實驗中菌株LS-1從高溫酒曲中分離，所產(chǎn)蛋白酶活力較高，在50℃生長仍然能夠生長并分泌胞外蛋白酶，說明該菌株和其分泌蛋白酶均具有一定耐熱性。下一步將對其酶學性質(zhì)進行研究，為該酶在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。

參考文獻

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[3]劉曉光，謝和，屈直.醬香型白酒風味物質(zhì)的形成與微生物關(guān)系的研究現(xiàn)狀與進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2007，35（2）：131-134.

[4]曾德勇，方鎰，劉濤，等.醬香型高溫大曲中高產(chǎn)蛋白酶細菌的分離及鑒定[J].釀酒科技，2015（3）：27-30.

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[6]王俊英，侯小歌，張杰，等.酒曲中高蛋白酶產(chǎn)生菌篩選及酶學性質(zhì)研究[J].中國釀造，2012，31（4）：33-36.

（責編：張宏民）