宗樹斌 王永平 任煥煥

摘 要：以帶腋芽莖段為外植體，通過外植體消毒試驗和培養(yǎng)基、激素種類及激素濃度正交試驗對藍雪花組培快繁無菌體系的建立進行研究。結果表明：外植體消毒用10%次氯酸鈉滅菌8min，或用0.1%升汞滅菌6min，效果最佳，滅菌充分，致死率低。激素種類因素是影響誘導率的主導因素，試驗最佳的組合是WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT），誘導率達到92.3%。

關鍵詞：藍雪花;外植體;組織培養(yǎng)

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2018）24-0016-4

Abstract：Stem segments with axillary buds were used as explants to study the establishment of the rapid propagation aseptic system of Plumbago auriculata through explant disinfection experiment ，and? orthogonal experiment of culture medium，hormone types and hormone concentration. The results showed that the best sterilization time of explants with 10% sodium hypochlorite was 8 minutes，the best sterilization time was 6 minutes with 0.1% liter mercury，the best sterilization time was filled with sterilization and mortality rate is low. Orthogonal test showed that hormone type was the dominant factor affecting the induction rate，and the best combination was WPM medium + 0.4mg/L zeatin （ZT） treatment，the induction rate reached 92.3%.

Key words：Plumbago auriculata;Explant;Tissue Culture

藍雪花（Plumbago auriculata）原產南非，又名藍花丹、藍雪丹、藍花磯松、藍茉莉等，為白花丹科（藍雪科）白花丹屬多年生常綠灌木。藍雪花長勢強健，耐熱，較耐高溫高濕，病蟲害少，管理簡單，觀賞期長。葉色翠綠，花色淡雅，炎熱的夏季給人以清涼感覺，可盆栽點綴居室、陽臺;成熟植株枝條懸垂，適宜大型容器組合盆栽，可用于場館周邊道路、立交橋等主要路段的綠化美化，可地栽林緣種植或點綴草坪[1]。藍雪花花期正值少花的夏季，而且是自然界少有的藍色花，受到園林工作者青睞[2]。藍雪花作為一種新優(yōu)觀花花卉被引種栽培，在一些重要綠化地段被推廣應用，發(fā)揮了很好的景觀效果，其種苗需求量逐年遞增，市場潛力巨大。另外，藍雪花含有大量白花丹素[3-4]，對風濕關節(jié)疼痛、血瘀經閉、跌打損傷、腫毒惡瘡以及疥癬均具有較好的治療作用[5]，兼具較高的觀賞價值和藥用價值[6]。

目前國內對藍雪花的研究剛剛起步，主要集中在其觀賞特性、引種栽培、生物學特性等方面[7]。對藍雪花的栽培管理和繁殖技術還主要只是一些經驗性的總結，在學術方面的系統(tǒng)研究則比較少[8]。藍雪花的繁育類型為異交型，開花強度不高，不利于吸引昆蟲，不利于生殖成功，加之藍雪花是典型的花柱異型植物，且具有自交不親和性，故缺少傳粉者則其結實率很低[9]。且其種子價格較為昂貴，擴繁系數低，造成目前傳統(tǒng)繁殖方式已無法滿足藍雪花的應用需求。對藍雪花無性繁殖技術的研究主要在于扦插繁殖技術[10，11]。組織培養(yǎng)快速繁殖技術可以克服傳統(tǒng)繁殖方法的不足，繁殖系數大、速度快、保持優(yōu)良性狀，特別適合工廠化繁育等。因此，對藍雪花開展組織培養(yǎng)研究，建立無菌體系，是藍雪花組培工廠化繁育技術體系的基礎，同時也為藍雪花利用組織培養(yǎng)技術進行遺傳育種及有用物質的制備提取奠定基礎，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 以江蘇農林職業(yè)技術學院玻璃溫室盆栽培育的2年生藍雪花為母株，采集生長健壯、發(fā)育充實、無病蟲害的當年生枝條，在枝條的中上段，去掉葉片，剪取帶腋芽的莖段為藍雪花組織培養(yǎng)的外植體。

1.2 試驗地概況 試驗在江蘇農林職業(yè)技術學院風景園林學院實訓基地進行。實訓基地有現代化的玻璃溫室2700m2和設備齊全的組培室300m2，基地常年進行多種觀賞植物的引種、栽培繁育工作，能夠為試驗提供充足良好的條件。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體消毒方法 把剪取好的帶腋芽的莖段放入燒杯，蒙上1層紗布，在流水下沖洗30min，拿到接種室無菌操作臺上，先用75%酒精消毒60s，倒掉酒精，用無菌水沖洗1遍，然后按照表1的要求各處理采用不同的滅菌劑及滅菌時間進行消毒，最后再用無菌水沖洗3～5遍，外植體消毒完成。在無菌操作臺上，用消過毒的剪刀和鑷子對外植體進一步剪切，使外植體腋芽上端保留0.5～1cm長度，腋芽下端保留0.5～1cm長度，把剪切好的外植體接種到MS培養(yǎng)基的試管內，每個試管接種1個外植體，每處理接種30支試管，試驗重復3次。放在培養(yǎng)室內進行培養(yǎng)，注意觀察記錄接種苗的污染情況、成活情況及致死情況。試管內染菌既為污染，試管內沒有菌且腋芽萌動既為成活，試管內沒菌但腋芽沒有萌動既為致死。30d后統(tǒng)計計算各處理的污染率、成活率、致死率，分析得出最佳的外植體消毒方法。

1.3.2 培養(yǎng)基及激素選擇的正交試驗 采用1.3.1研究得出的方法進行外植體消毒，對藍雪花初代培養(yǎng)無菌體系的建立進行初代培養(yǎng)基及激素濃度選擇的進一步研究試驗，把培養(yǎng)基、激素種類、激素濃度作為3個因素，每個因素設3個水平，因素水平見表2，采用正交設計表L9（34）進行試驗，正交試驗表見表3。

按照正交試驗表，每處理接種10個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶接種10個外植體，試驗重復3次，隨機區(qū)組設計。把培養(yǎng)瓶放置在溫度（25±1）℃、光照強度36～54μmol/m2·s，光周期（12h光照/12h黑暗）條件下進行培養(yǎng)。觀察記錄外植體的分化誘導情況，60d后統(tǒng)計記錄各處理的有效誘導苗數（有效誘導苗是指誘導芽苗高度2cm以上，至少含有1個莖節(jié)），計算各處理的誘導率。

誘導率（%）=（有效誘導苗數/接種苗數）×100

對各處理的誘導率利用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，進行極差分析、方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒方法 觀察記錄各處理外植體的生長情況，記錄下污染的試管數、成活的試管數以及致死的試管數，算出各處理的平均污染率、平均成活率和平均致死率，結果如表4所示。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

試驗采用了10%次氯酸鈉和0.1%升汞2種滅菌劑進行不同時間處理，根據表4結果，分別對10%次氯酸鈉和0.1%升汞不同滅菌時間處理的滅菌效果作直觀分析，如圖1、2所示。

由圖1和圖2可以看出，隨著滅菌時間的延長，污染率逐漸降低，成活率逐漸升高，而隨著滅菌時間的進一步延長，開始出現致死率，并隨時間的延長致死率逐漸提高，而成活率則相應降低。這是因為滅菌劑在一定時間內可以殺死細菌，但時間過長滅菌劑同樣會對外植體有傷害作用使外植體致死。因此，在組培無菌體系建立外植體消毒時，均需準確找到1個時間節(jié)點，使得外植體能夠滅菌充分，而又不會被致死。從圖1可以看出，利用10%次氯酸鈉滅菌劑消毒時滅菌時間8min為最佳，滅菌充分，而致死率很低;從圖2可以看出，利用0.1%升汞進行消毒時滅菌6min為最佳。同時，比較圖1和圖2，從成活率和致死率的走勢可以判斷，0.1%升汞相對10%次氯酸鈉更為敏感，在進行滅菌消毒時對時間的要求更為嚴格。

2.2 培養(yǎng)基及激素選擇 統(tǒng)計培養(yǎng)基及激素濃度正交試驗各處理的有效誘導苗數，算出各重復處理的誘導率，試驗結果如表5所示。

由表5可知，平均誘導率最高的處理是處理9達到了92.3%，即誘導培養(yǎng)結果最佳的組合WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT）。

2.2.1 極差分析 對表5正交試驗結果數據作極差分析（見表6）。通過極差分析得出最優(yōu)組合是WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT），這與試驗結果是一致的。各因素對誘導率的影響大小依次為激素種類>激素濃度>培養(yǎng)基。

2.2.2 方差分析 對表5正交試驗結果數據作方差分析。由表7可以看出，各因素對誘導率的影響，培養(yǎng)基和激素濃度顯著性均未小于0.05，影響均不顯著，而激素種類顯著性小于0.01，影響極顯著。對激素種類作進一步的多重比較分析。

2.2.3 多重比較 對激素種類對誘導率的影響進行用LSD檢驗多重比較。由表8可知，激素種類因素中，誘導率最高的是玉米素（ZT），平均誘導率達到91.33%;其次是6-BA，平均誘導率81.33%，與玉米素的差異達到極顯著水平;誘導率最低的是IAA，平均誘導率為71.56%，與6-BA的差異也達到了極顯著水平。

3 結論與討論

利用帶腋芽莖段為外植體進行藍雪花組織培養(yǎng)，外植體消毒可以先用75%酒精滅菌60s后，再用10%次氯酸鈉滅菌8min，或者用0.1%升汞滅菌6min，均能起到很好的消毒效果，滅菌比較充分，且致死率低。0.1%升汞滅菌劑相對10%次氯酸鈉滅菌劑較為敏感，對滅菌時間要求更嚴。其他常見滅菌劑如過氧化氫、硝酸銀、溴水等滅菌時間需要作具體的試驗研究。

通過對培養(yǎng)基、激素種類、激素濃度3因素正交試驗，研究了藍雪花組培初代培養(yǎng)無菌體系建立的條件。3因素中激素種類對誘導率的影響最大，其次是激素濃度，最后是培養(yǎng)基。方差分析表明，激素種類對誘導率的影響極顯著，激素濃度和培養(yǎng)基對誘導率的影響均不顯著。進一步的多重比較表明，玉米素是最佳的激素處理，其次是6-BA，最后是IAA，3者之間的差異均達到了極顯著水平。綜合比較得到了最佳組合是WPM培養(yǎng)基+0.4mg/L玉米素（ZT）處理，最高誘導率達到92.3%。

參考文獻

[1]劉華敏.藍雪花的引種栽培[J].南方農業(yè)，2011（5）：49.

[2]葉劍秋.小庭園植物推薦藍雪花[J].園林，2008（5）：51.

[3]徐曄春.藍雪花[J].花木盆景，2010，3（5）：32.

[4]Crouch I J，Finnie J F，Staden J V. Studies on the isolation of plumbagao from in vitro and in vivo grown Drosera species[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1990，21：79-82.

[5]張倩睿.白花丹化學成分的研究[J].中藥材，2007，30（5）：558-560.

[6]Santosect，Paivas R，Kaplanmac，et al.Atividade antileishmania de Plumbagao scandens（Plumbaginaceae）[J].RevBras Farm，1997，78（1）：13-15.

[7]秦賀蘭.園林新秀藍雪花[J].中國花卉園藝，2007（16）：24.

[8]陳果.藍雪花（Plumbago auriculata）種子生物學與扦插繁殖特性初步研究[D].雅安：四川農業(yè)大學，2012.

[9]陳毅.藍雪花（Plumbago auriculata）植物組織培養(yǎng)技術研究[D].雅安：四川農業(yè)大學，2013.

[10]周亮，謝桂林，鄒義萍.藍雪花扦插繁殖技術研究[J].西北大學學報（自然科學版），2017，47（1）：82-86.

[11]宗樹斌，顧立新，盧卡斯·斯考特.藍雪花嫩枝扦插技術[J].福建林業(yè)科技，2015，9（3）：121-124.

（責編：徐世紅）