王宏偉 蘇軻 謝波

[摘要]目的 建立2型糖尿病大鼠模型，探討黃連對(duì)2型糖尿病大鼠炎癥因子的影響。方法 利用高脂高糖飼料飼養(yǎng)誘導(dǎo)與鏈脲佐菌素（STZ）聯(lián)合造模，將造模成功的60只雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組（二甲雙胍0.097 g/kg）、黃連高劑量組（4.360 g/kg）、黃連中劑量組（2.910 g/kg）、黃連低劑量組（1.450 g/kg），每組各10只。給藥組均灌胃給藥3周，同時(shí)正常組、模型組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液。3周后分別測(cè)定各組的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）、一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）和急性期反應(yīng)蛋白（CRP）相關(guān)炎癥因子水平。結(jié)果 模型組的TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽性組、黃連高、中劑量組的TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中黃連高劑量組的TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP水平與陽性組相當(dāng)（P>0.05）；黃連低劑量組的TNF-α、PEG2水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；黃連低劑量組的IL-1、NO和CRP水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 黃連可以降低2型糖尿病大鼠的炎癥因子水平，為研究2型糖尿病的潛在發(fā)病機(jī)制及黃連的藥理機(jī)制提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]黃連；2型糖尿??；炎癥因子

[中圖分類號(hào)] R56 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）12（c）-0035-03

[Abstract] Objective To establish the rat model of type 2 diabetes mellitus （T2DM） and explore the effect of Rhizoma Coptidis （RC） on inflammatory factors in T2DM rats. Methods The rats were fed with high-fat and high-sugar diet and induced by streptozotocin （STZ） for modeling. A total of 60 male rats were randomly divided into normal group， model group， positive group （0.097 g/kg Metformin）， RC high-dose group （4.360 g/kg）， RC middle-dose group （2.910 g/kg）， and RC low-dose group （1.450 g/kg）， with 10 rats in each group. The drug-administered groups were intragastrically administered for 3 weeks. At the same time， the identical amount of 0.5% sodium carboxymethylcellulose （CMC-Na） was gavaged in the normal and model group. The levels of tumor necrosis factor α （TNF-α）， interleukin-1 （IL-1）， nitric oxide （NO）， prostaglandin E2 （PGE2）， and C-reactive protein （CRP） at an acute stage after 3-week intervention were determined. Results The levels of TNF-α， IL-1， NO， PEG2 and CRP in the model group were higher than those in the normal group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-1， NO， PEG2 and CRP in the positive group， RC high-dose group and RC middle-dose group were lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-1， NO， PEG2 and CRP in the RC high-dose group were similar to those in the positive group （P>0.05）. The levels of TNF-α and PEG2 in the RC low-dose group were lower than those in the model group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of IL-1， NO and CRP in the RC low-dose group were not significantly different from those in the model group （P>0.05）. Conclusion RC can reduce the levels of inflammatory factors in T2DM rats， and provide a theoretical basis for studying the potential pathogenesis of T2DM and the pharmacological mechanism of RC.

[Key words] Rhizoma Coptidis； Type 2 diabetes mellitus； Inflammatory factors

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的慢性代謝性疾病，其主要病理特征是胰島素分泌缺陷或作用障礙導(dǎo)致葡萄糖升高[1]。2型糖尿病具有胰島素抵抗或分泌不足的特征，一般不需要依賴注射胰島素[2]。其病理機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，目前炎癥學(xué)說是接受度較高的發(fā)病機(jī)制之一[3-4]。該學(xué)說認(rèn)為炎癥因子可抑制細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，造成高胰島素血癥，從而誘發(fā)胰島素抵抗。其次，過量炎癥因子還可直接抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，引起胰島素抵抗。另外，臨床研究表明，2型糖尿病患者伴有持續(xù)的低度炎癥反應(yīng)，因此其屬于慢性炎癥性疾病[5]。其涉及到的炎癥標(biāo)志物有：腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1、6、8（IL-1、6、8）、急性期反應(yīng)蛋白（CRP）、脂聯(lián)素、干擾素（IFN）等。因此，改善體內(nèi)的持續(xù)性炎癥反應(yīng)與糖尿病的治療有密切關(guān)系。

黃連首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《中國藥典》（2015版）規(guī)定其為毛茛科植物黃連（Coptis Chinensis Franch）、三角葉黃連（Coptis Deltoidea C.Y.Chenget Hsiao）或云連（Coptis Teeta Wall.）的干燥根莖，其味苦、性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)[6]。在中醫(yī)理論中，糖尿病屬于“消渴病”范疇，發(fā)展早期以“濕熱瘀阻”為主，治療以清泄火熱為主[7-8]。中藥黃連被用作治療“消渴病”具有悠久的歷史[9]?！侗静菥V目》云：“治消渴，用酒蒸黃連”；《名醫(yī)別錄》亦云：“黃連止消渴”?；谝陨侠碚撝笇?dǎo)，本研究擬采用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型，探討黃連提取物對(duì)其炎癥水平的影響，以期為研究2型糖尿病的潛在發(fā)病機(jī)制及黃連的藥理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

G-421型血糖儀（愛奧樂）；分析天平[New Classic ML梅特勒-托利多（美國）]；真空干燥箱（上海一恒DZF-6020）；黃連（購于本地藥材市場，經(jīng)相關(guān)專家鑒定為毛茛科植物Coptis Chinensis Franch）；STZ[Sigma公司（美國），批號(hào)：019k1022]；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na上?？道噬锟萍加邢薰荆欢纂p胍（中美海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：AAL3451）；高脂高糖飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司，批號(hào)：20161217）；TNF-α檢測(cè)試劑盒（天津九鼎生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170325）；IL-1檢測(cè)試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170215）；PGE2 ELISA試劑盒（美國Cayman公司）；NO試劑盒（碧云天生物公司）；CRP試劑盒（北京利德曼生化股份有限公司）；酶標(biāo)儀（北京生物科技有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，體重200～220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)碼：201300 16007059），飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物飼養(yǎng)室，按屏障環(huán)境內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察與操作規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3方法

1.3.1黃連提取物的制備 取黃連藥材2 kg，加10倍量95%乙醇提取2次，每次2 h，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，真空干燥得到提取物。

1.3.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 將60只雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)取10只作為正常組，喂養(yǎng)普通飼料。其余大鼠用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ溶液（35 mg/kg），3 d后測(cè)定血糖，將2個(gè)星期后血糖依舊穩(wěn)定，且空腹血糖>11.1 mmol/L的大鼠納入2型糖尿病模型。

1.3.3分組與給藥方案 將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性組（二甲雙胍0.097 g/kg），根據(jù)臨床用藥劑量換算，將給藥組分為黃連高劑量組（4.360 g/kg）、黃連中劑量組（2.910 g/kg）、黃連低劑量組（1.450 g/kg），每組各10只。正常組與模型組按0.010 ml/g給藥體積給予0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），各給藥組分別給藥，每天1次，連續(xù)給藥3周。

1.3.4炎癥因子水平測(cè)定 給藥3周后，各組大鼠眼眶取血，3500 r/min離心10 min，分離血清，采用Griess法或ELISA等方法測(cè)定TNF-α、IL-1、NO、PGE2和CRP相關(guān)炎癥因子的水平，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

模型組的TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP水平均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；陽性組、黃連高、中劑量組的TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中黃連高劑量組的TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP水平與陽性組相當(dāng)（P>0.05）；黃連低劑量組的TNF-α、PEG2水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；黃連低劑量組的IL-1、NO和CRP水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

3討論

隨著中國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平正逐步提高，糖尿病的發(fā)病人數(shù)（2型糖尿病為主）也逐年攀升，嚴(yán)重威脅著人類的健康[10]。2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前其病因尚未完全闡明。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)糖尿病作了大量研究[11-13]，接受度較高的病理機(jī)制之一為炎癥學(xué)說。糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，但中醫(yī)藥對(duì)其機(jī)制研究尚不夠深入，這在一定程度上限制了中醫(yī)藥在臨床的應(yīng)用[14]。本研究將成功造模的2型糖尿病大鼠口服黃連提取物后檢測(cè)其炎癥因子水平，探究中藥黃連對(duì)2型糖尿病的治療作用，為研究2型糖尿病的潛在機(jī)制及黃連的藥理機(jī)制提供依據(jù)。

本研究選取測(cè)定的炎癥因子具有代表性且相對(duì)較全，結(jié)果顯示，模型組大鼠5種炎癥因子（TNF-α、IL-1、NO、PEG2、CRP）水平均顯著高于正常組，而二甲雙胍作為代表性降糖藥，陽性組大鼠炎癥因子水平顯著低于模型組（P<0.05），其從正面和側(cè)面均提示2型糖尿病和炎癥發(fā)生具有一定的相關(guān)性，為研究其潛在的發(fā)生機(jī)制提供了理論依據(jù)。其次也提示2型糖尿病發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與體內(nèi)多種信號(hào)通路有關(guān)，如和TNF-α、IL-1炎癥因子相關(guān)的IKK/NF-κB通路[15]、NO相關(guān)的一氧化氮合酶（iNOS）/NO通路等有關(guān)[16]。黃連高劑量組的炎癥因子水平與陽性組相當(dāng)，而顯著低于模型組，提示黃連對(duì)2型糖尿病具有一定的治療作用。黃連低劑量組與黃連高劑量組比較，其炎癥因子水平較高，與模型組無顯著差別，提示黃連低劑量時(shí)對(duì)2型糖尿病的治療效果相對(duì)較差，進(jìn)而推測(cè)黃連治療2型糖尿病存在一定的量-效相關(guān)性，這將為黃連在臨床上的應(yīng)用提供參考。

綜上所述，黃連可以降低2型糖尿病大鼠的炎癥因子水平，為研究2型糖尿病的潛在發(fā)病機(jī)制及黃連的藥理機(jī)制提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Zimmet PZ，Magliano DJ，Herman WH，et al.Diabetes：a 21st century challenge[J].Lancet Diabetes Endocrinol，2014，2（1）：56-64.

[2]Chamberlain JJ，Herman WH，Leal S，et al.Pharmacologic therapy for type 2 diabetes：synopsis of the 2017 American Diabetes Association Standards of Medical Care in Diabetes[J].Ann Intern Med，2017，166（8）：572-578.

[3]Marchetti P.Islet inflammation in type 2 diabetes[J].Diabetologia，2016，59（4）：668-672.

[4]Hameed I，Masoodi SR，Mir SA，et al.Type 2 diabetes mellitus：from a metabolic disorder to an inflammatory condition[J].World J Diabetes，2015，6（4）：598.

[5]段雨函，李宗清.2型糖尿病患者血清抵抗素水平與血糖及炎癥因子的相關(guān)性研究[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2016， 23（9）：1045-1048.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].2015年版一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[7]羅清艷.有關(guān)中醫(yī)藥治療糖尿病消渴癥的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代養(yǎng)生，2017，（18）：153.

[8]文穎娟.消渴病癥研究述評(píng)[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2014，25（1）：156-159.

[9]仝小林.黃連為主藥系列經(jīng)方在糖尿病辨治中的運(yùn)用[J].中醫(yī)雜志，2013，54（3）：209-211.

[10]Yang L，Shao J，Bian Y，et al.Prevalence of type 2 diabetes mellitus among inland residents in China （2000-2014）：a meta-analysis[J].J Diabetes Invest，2016，7（6）：845-852.

[11]Koffler M，Ramirez LC，Raskin P.Insulin resistance and diabetes，mechanism and possible intervention[J].Diabetes Res Clin Pr，2015，7（2）：83-98.

[12]Al-Goblan AS，Al-Alfi MA，Khan MZ.Mechanism linking diabetes mellitus and obesity[J].Diabetes Metab Syndr Obes，2014，7：587-591.

[13]Han JL，Lin HL.Intestinal microbiota and type 2 diabetes：from mechanism insights to therapeutic perspective[J].World J Gastroenterol，2014，20（47）：17737-17745.

[14]陳芳，劉東波.中藥活性成分降血糖作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012，40（4）：123-127.

[15]Fu J，Shi Q，Song X，et al.Tetrachlorobenzoquinone exhibits neurotoxicity by inducing inflammatory responses through ROS-mediated IKK/IκB/NF-κB signaling[J].Environ Toxicol Pharmacol，2016，41（1）：241-250.

[16]鄭海崇，曾勉，何婉媚，等.Ghrelin對(duì)膿毒癥大鼠肺泡巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路Akt、NF-κB和iNOS的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2018，39（1）：1-8.