左小龍 喬秀芹
(1 北京市順義牛欄山第一中學(xué) 北京 101301 2 北京市順義區(qū)教育研究和教師研修中心 北京 101300)
在生物學(xué)教學(xué)中,教師應(yīng)積極提供機(jī)會(huì)讓學(xué)生親自嘗試和實(shí)踐,并依據(jù)觀察到的事實(shí)進(jìn)行深度思考[1],進(jìn)而加深對(duì)生物學(xué)概念的理解,提升應(yīng)用知識(shí)的能力?!叭~綠體色素的提取和分離”是《普通高中生物課程標(biāo)準(zhǔn)》中必修1“細(xì)胞的代謝”單元中的重要實(shí)驗(yàn)。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)可讓學(xué)生認(rèn)識(shí)葉綠體色素的種類和顏色,了解葉片呈現(xiàn)綠色這一表象背后的實(shí)質(zhì),進(jìn)而為光合作用過(guò)程和應(yīng)用的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ),同時(shí)體會(huì)層析原理及層析法在物質(zhì)分離中的重要作用。
由于葉綠體中色素為脂溶性,且不同色素在有機(jī)溶劑中的溶解度不同,因此人教版教材中的此實(shí)驗(yàn)以無(wú)水乙醇為提取液,以石油醚∶丙酮∶苯=20∶2∶1 的混合有機(jī)溶劑作為層析液,再用濾紙條作為分離介質(zhì),完成對(duì)葉綠體色素的提取和分離。此實(shí)驗(yàn)?zāi)茏寣W(xué)生了解葉綠體色素的種類和顏色,但層析液中含有致癌物質(zhì)苯[2],影響師生的健康;劃濾液細(xì)線時(shí)易出現(xiàn)細(xì)線過(guò)寬且色素含量少的情況;層析后色素帶不整齊、不明顯清晰[3];學(xué)生完成此實(shí)驗(yàn)后,對(duì)層析液的組成和層析原理可能存在認(rèn)識(shí)誤區(qū),例如認(rèn)為層析液只能是教材中的固定配比、層析后色素條帶的順序是固定不變的等。
鑒于此,筆者對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一系列改進(jìn)和延伸,旨在讓學(xué)生更加深刻地理解層析技術(shù)及其原理,弄清葉綠體色素的種類和功能。改進(jìn)方案,遵循簡(jiǎn)單化原則,在保證實(shí)驗(yàn)效果理想的前提下,降低對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求,同時(shí)簡(jiǎn)化操作步驟,以便更廣泛地開(kāi)展學(xué)生實(shí)驗(yàn)。
2.1 實(shí)驗(yàn)材料與用具
1)材料:新鮮菠菜葉。
2)試劑:提取液(無(wú)水乙醇∶石油醚=2∶3)、層析液(石油醚∶丙酮=5∶4)、蒸餾水、二氧化硅、碳酸鈣。
3)用具:研缽、稱量紙、剪刀、藥匙、天平、玻璃漏斗、濾紙、試管、移液管、吸耳球、試管架、硅膠G 層析板(青島海洋化工廠)、毛細(xì)吸管、燒杯、培養(yǎng)皿蓋、離心機(jī)、1.5 mL 離心管、1 000 μL 移液器、比色皿(0.5 cm 厚)、刀片、三棱鏡。
硅膠層析板的處理: 直接購(gòu)買(mǎi)的硅膠G 層析板(青島海洋化工廠)規(guī)格為20 cm×10 cm,使用前需先置于烘箱中,60℃下烘干1 h,然后用玻璃刀從背面進(jìn)行切割,切割成2 cm(寬)×10 cm(長(zhǎng))規(guī)格,此項(xiàng)操作需一定的技巧,由教師在課前完成。
2.2 實(shí)驗(yàn)報(bào)告單 為了培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力和探究思維,本實(shí)驗(yàn)先不給出實(shí)驗(yàn)原理,也未將可能出現(xiàn)的現(xiàn)象告訴學(xué)生,而是設(shè)計(jì)成探究性問(wèn)題放在討論分析中。現(xiàn)象不是教師告知的,而是學(xué)生自己觀察發(fā)現(xiàn)的;原理不是教師講解的,而是學(xué)生自主查閱和研究獲得的[4]。
課前發(fā)放實(shí)驗(yàn)報(bào)告單,學(xué)生熟悉實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程。實(shí)驗(yàn)報(bào)告單設(shè)計(jì)如表1。
表1 “葉綠體色素的提取與分離”實(shí)驗(yàn)報(bào)告單
3.1 色素提取 取5 g 新鮮菠菜葉,剪碎,置于研缽中。向研缽中加入少許二氧化硅和碳酸鈣,再加入提取液10 mL,迅速、充分地進(jìn)行研磨[5]。將研磨液迅速倒入玻璃漏斗中進(jìn)行過(guò)濾,濾液收集到試管中后,加入與濾液等體積的蒸餾水,此時(shí)試管中液體出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象,即色素溶于石油醚在上層,無(wú)水乙醇進(jìn)入水層在下層。用移液管吸取上層深綠色濾液轉(zhuǎn)移至小燒杯中。由于經(jīng)過(guò)了一次萃取,加上石油醚易揮發(fā),所以改進(jìn)后的色素提取方法可極大提高濾液中色素的濃度,從色素提取液的顏色上可直觀反映。
3.2 色素分離 嘗試用薄層層析法取代原實(shí)驗(yàn)中的紙層析法。薄層層析法是一種較新的分離物質(zhì)的方法,具有快速、微量、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)。筆者在實(shí)驗(yàn)中用硅膠G 層析板代替濾紙。硅膠G 層析板吸附能力強(qiáng),能承載更為大量的色素,且質(zhì)地均勻,分離的色素條帶更加清晰、整齊。
分離色素的過(guò)程如下:
1)層析液的配制:薄層層析的層析液由5 份石油醚和4 份丙酮混合而成。將9 mL 層析液加至250 mL 燒杯中,蓋好培養(yǎng)皿蓋靜置10 min,使氣態(tài)相達(dá)到飽和。
2)畫(huà)濾液細(xì)線:用毛細(xì)吸管吸取適量濾液,在硅膠板的一端距邊緣1 cm 處,從左至右不間斷地快速畫(huà)線。由于此時(shí)濾液中的石油醚揮發(fā)較快,因此能迅速干燥,短暫間隔后,再重復(fù)3~4 次,確保硅膠板上吸附有足量的色素。
3)層析:將劃好濾液細(xì)線的硅膠板有濾液細(xì)線的一側(cè)朝下放入燒杯,蓋好培養(yǎng)皿進(jìn)行色素的分離,透過(guò)燒杯,學(xué)生可清晰觀察到層析過(guò)程。
由于硅膠板比較硬,所以濾液細(xì)線不會(huì)沒(méi)入層析液中;一個(gè)燒杯中可放數(shù)個(gè)硅膠板,且彼此互不干擾。層析的速度也很快,硅膠板從上至下依次能觀察到胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素,還能觀察到呈褐色的去鎂葉綠素和橙黃色的姜黃素,色素帶直且齊。
為了使學(xué)生更直觀地認(rèn)識(shí)葉綠體中色素在光合作用中的作用,筆者在教學(xué)中對(duì)此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了拓展和延伸。
3.3 單一色素的再提取 用刀片將硅膠板上的胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素4 條色素條帶(含硅膠粉末)分別刮下來(lái),按4 人小組分類集中,再將含有4 種不同色素的硅膠粉末分別置于1.5 mL 離心管內(nèi),加入適量無(wú)水乙醇,用毛細(xì)吸管進(jìn)行攪拌混勻,以2 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心3 min,然后用1 000 μL 移液器吸取上層濾液,獲得4 種單一色素的提取液(圖1),分別置于0.5 cm 厚的比色皿中。
圖1 單一色素的再提取
3.4 不同色素吸收光譜的測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上讓直射白光通過(guò)三棱鏡,可在后方白板上看到七色光譜。將盛有4 種不同色素的的提取液分別置于三棱鏡和白板之間,則可觀測(cè)到不同色素對(duì)不同顏色光的吸收不同。結(jié)果顯示:葉黃素和胡蘿卜素主要吸收藍(lán)紫光,葉綠素a 和葉綠素b 主要吸收紅光和藍(lán)紫光,仔細(xì)觀察還會(huì)發(fā)現(xiàn),在紅光區(qū)葉綠素a 相比葉綠素b 有更大的吸收能力。
圖2 葉綠體色素的熒光現(xiàn)象
3.5 熒光現(xiàn)象觀察 將色素提取液置于試管之中,用燈光照射,可清晰觀察到葉綠素在透射光下呈綠色,而在反射光下呈紅色,即熒光現(xiàn)象(圖2)。
本實(shí)驗(yàn)對(duì)葉綠體色素的提取和分離方法進(jìn)行了改進(jìn),對(duì)色素功能的探索進(jìn)行了延伸,將葉綠體色素的種類和功能這2 部分知識(shí)緊密聯(lián)系在一起。學(xué)生親歷了實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程,并在此過(guò)程中加深了對(duì)重要概念的理解。
1)教材實(shí)驗(yàn)的結(jié)果讓學(xué)生明白了葉綠體色素的種類和顏色。其中,提取方法的改進(jìn)突顯出葉綠體色素的脂溶性特點(diǎn):用石油醚和無(wú)水乙醇提取,再進(jìn)一步用水分層,前、后2 次操作能充分體現(xiàn)色素易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)。層析方法的改進(jìn)有助于學(xué)生加深對(duì)層析原理的理解: 用薄層層析法替代紙層析,這一介質(zhì)的替換,讓學(xué)生對(duì)層析法這一物質(zhì)分離技術(shù)有了新的認(rèn)識(shí),而替代后出現(xiàn)的與紙層析不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更是引發(fā)了學(xué)生的思考,學(xué)生更易理解條帶順序與層析液的組成和配比有關(guān),與不同色素在層析液中的溶解度不同有關(guān)。
2)拓展實(shí)驗(yàn)中吸收光譜的測(cè)定有助于學(xué)生對(duì)葉綠體色素功能的理解; 熒光現(xiàn)象的觀察能引發(fā)學(xué)生深入思考,為光合作用過(guò)程的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ):綠色葉片在自然狀態(tài)下為何觀察不到熒光? 葉綠體內(nèi)的色素吸收的光能去哪了? 學(xué)生帶著問(wèn)題走出實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)一步尋找答案,這樣既激發(fā)其繼續(xù)學(xué)習(xí)和探究的欲望,也讓實(shí)驗(yàn)與理論在內(nèi)容和邏輯上聯(lián)系得更加緊密。