劉婷婷 許棟明 孫芳玲 鄭文榮 祝自新 田 欣 郭德玉 王 文

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053) (2. 科技部火炬高技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)中心，北京 100038)

缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致殘疾和死亡的主要原因之一[1]。很多信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)缺血性腦卒中的病理生理過(guò)程，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的異常激活是缺血性腦損傷后的重要調(diào)控機(jī)制，其與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，是調(diào)控缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的一個(gè)重要因素[2]。在細(xì)胞正常分裂時(shí)，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的激活可以促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，但許多疾病中，病理刺激導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白異常激活，使處于分化末期的部分神經(jīng)細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。很多蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期的過(guò)程，其中包括cyclins、cyclin激活酶(cyclin-activated kinases, CDKs)、cyclin激酶抑制劑CDKIs(cyclin-dependent kinase inhibitors, CDKIs)等。細(xì)胞周期激活以后D型cyclins合成，其與CDK6結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞從G0進(jìn)入G1期，該過(guò)程為進(jìn)入細(xì)胞周期的起始，也是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵。有研究表明，通過(guò)降低D型cyclins及其激酶，抑制細(xì)胞由G0進(jìn)入G1期，可以減少大腦缺血性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[3]。通過(guò)抑制缺血性腦損傷后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的異常激活，可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

莫諾苷是從中藥山茱萸中提取的一種單體化合物，我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其對(duì)缺血性腦卒中損傷大鼠有抗炎、抗凋亡、改善大鼠神經(jīng)功能的作用[4-5]。在前期研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)用蛋白免疫印跡的方法進(jìn)一步研究莫諾苷是否可以調(diào)節(jié)缺血性腦卒中大鼠患側(cè)海馬CyclinD1、CDK6的蛋白表達(dá)情況，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性 Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量260～280 g，SPF級(jí)，合格證編號(hào)：SYXK(京)2017-0033， 購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及藥品：CyclinD1小鼠單克隆一抗(WH0001019M3)，CDK6小鼠單克隆一抗(WH000102M1)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(ZB-2010)購(gòu)自北京市中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RIPA 裂解液(P0013B)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。BCA法蛋白定量試劑盒(P1511)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。ECL Western Blotting Kit(32109)購(gòu)自美國(guó) THERMO-PIERCE公司。莫諾苷由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室從中藥山茱萸中提取，HPLC分析純度大于98.5%。

1.2 方法

1.2.1大鼠MCAO模型制作及分組：大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用改良Zea Longa線栓法[6-7]制備局灶性腦缺血再灌注模型。腹腔注射10%水合氯醛 3.5 mL/kg進(jìn)行麻醉，將直徑為0.26 mm的尼龍線從右頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至距頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約 1.8 cm時(shí)，會(huì)有阻擋感，說(shuō)明栓線已越過(guò)大腦中動(dòng)脈，到達(dá)大腦前動(dòng)脈的起始部。栓塞30 min后，拔出尼龍線。假手術(shù)組除不插入尼龍線外其他操作與手術(shù)組相同。根據(jù)5分制評(píng)分方法，剔除模型不成功的大鼠后，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組，模型組，莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、 大(270 mg/kg)劑 量 組。術(shù)后連續(xù)灌胃給藥 7 d，每天給藥 1 次，其中假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.2.2Western blot分析：術(shù)后 7 d，大鼠 10%水合氯醛 3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉。迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)?，取出患?cè)海馬包入錫箔紙中，放入液氮中凍存片刻，-80 ℃保存。取患側(cè)海馬于 5 mL EP 管中稱重，加入預(yù)冷的裂解液 7 μL/mg組織、PMSF 1 μL/100 μL RIPA，冰上充分超聲粉碎。4 ℃靜止 30 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min。取上清測(cè)定蛋白濃度，總蛋白與 5×上樣緩沖液 1∶4稀釋，95 ℃變性10 min。

采用 10% SDS-PAGE 分離膠，濃縮膠用 5% SDS-PAGE。電泳：濃縮膠電壓60 V，40 min，分離膠電壓90 V，90 min，分離蛋白。電泳后用 0.45 μm NC 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；條帶在 5%脫脂奶粉中封閉 2 h；分別用小鼠單克隆CyclinD1 抗體(1∶1000)、小鼠單克隆CDK6抗體(1∶1000)和小鼠單克隆β-actin 抗體(1∶1000)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。加相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌 3次，每次 10 min；ECL顯色1 min，濾去顯色液，凝膠成像儀拍片。用Quanity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 莫諾苷對(duì)患側(cè)海馬CyclinD1蛋白表達(dá)的影響

用Western blot 的方法檢測(cè)局灶性腦缺血大鼠患側(cè)海馬CyclinD1蛋白表達(dá)的情況。如圖1所示，與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)海馬組織CyclinD1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，莫諾苷中劑量組與大劑量組患側(cè)海馬組織CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05;P<0.05)；莫諾苷小劑量組患側(cè)海馬組織CyclinD1表達(dá)有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 各組患側(cè)海馬組織CyclinD1蛋白表達(dá)情況注：#P<0.05與假手術(shù)組相比，*P<0.05與模型組相比Fig.1 The expression of CyclinD1 in ipsilateral hippocampus in each groupNote：#P<0.05 vs sham group，*P<0.05 vs model group

2.2 莫諾苷對(duì)患側(cè)海馬CDK6蛋白表達(dá)的影響

用Western blot 的方法檢測(cè)局灶性腦缺血大鼠患側(cè)海馬CDK6蛋白表達(dá)的情況。如圖2所示，與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)海馬組織CDK6蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，莫諾苷中劑量組與大劑量組患側(cè)海馬組織CDK6蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05;P<0.05)；莫諾苷小劑量組患側(cè)海馬組織CDK6表達(dá)有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 各組患側(cè)海馬組織CDK6蛋白表達(dá)情況注：#P<0.05與假手術(shù)組相比，*P<0.05與模型組相比Fig.2 The expression of CDK6 in ipsilateral hippocampus in each groupNote：#P<0.05 vs sham group，*P<0.05 vs model group

3 討論

細(xì)胞周期是非常復(fù)雜而微妙的過(guò)程，細(xì)胞進(jìn)入正常的細(xì)胞周期則進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂，而細(xì)胞進(jìn)入異常的細(xì)胞周期則激活凋亡信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-9]。近期研究表明，在急性和慢性神經(jīng)退行性疾病中，細(xì)胞周期信號(hào)通路參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的死亡[10-11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都證明，細(xì)胞周期的異常激活可以誘導(dǎo)caspase依賴的神經(jīng)元凋亡[12-13]。Chai等研究顯示，小檗堿可以抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡[3]。此外，我們前期用免疫組化的方法檢測(cè)患側(cè)海馬細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)莫諾苷的神經(jīng)保護(hù)作用很有可能與其可以降低缺血性腦卒中大鼠患側(cè)海馬CA1區(qū)CyclinD1與CDK6的陽(yáng)性細(xì)胞有關(guān)[14]。在該研究中我們用蛋白免疫印跡的方法，檢測(cè)局灶性腦缺血再灌注大鼠給藥7 d后患側(cè)海馬組織CyclinD1與CDK6的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們之前的研究結(jié)論。與前期研究結(jié)果一致，模型組與假手術(shù)組相比，CyclinD1及CDK6的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致缺血性腦損傷后進(jìn)入異常細(xì)胞周期的細(xì)胞增多，與Wen等研究一致[15]，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加。給予莫諾苷后，與模型組相比，CyclinD1與CDK6的表達(dá)顯著降低，與前期研究結(jié)果一致，表明莫諾苷可以起到抑制腦缺血導(dǎo)致的CyclinD1和CDK6過(guò)量表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)入異常細(xì)胞周期，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，缺血性腦損傷會(huì)使細(xì)胞周期相關(guān)蛋白異常激活，導(dǎo)致分化末期的神經(jīng)細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期，該過(guò)程可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。通過(guò)藥物抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白異常激活，阻止細(xì)胞進(jìn)入異常的細(xì)胞周期很可能成為腦卒中的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。