宋慶凱 尹博文 陳玲霞 李曉飛 苗雨潤 代解杰 孫曉梅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650118)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells, VECs)是存在于血管內(nèi)側(cè)的單層扁平上皮細(xì)胞。它將血管內(nèi)外分開，起著屏障作用。除此之外，血管內(nèi)皮細(xì)胞還起著其他重要的生理功能，如：血管調(diào)節(jié)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、凝血、免疫等。在病毒感染實(shí)驗(yàn)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞也是很好的模型，如曾有學(xué)者利用人血管內(nèi)皮細(xì)胞開展登革病毒、流感病毒等病毒感染機(jī)制研究。目前已有人[1]、大鼠[2]、兔[3]、犬[4]等的血管內(nèi)皮細(xì)胞獲得了體外原代培養(yǎng)。樹鼩作為人類近親，是建立病毒感染模型很好的材料。關(guān)于樹鼩主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)尚未見到相關(guān)報(bào)道。而由于樹鼩體型小，對于分離血管內(nèi)皮細(xì)胞有一定的難度，所以，探索一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)可行的分離、原代培養(yǎng)方法十分必要。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生兩日齡樹鼩，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～28 ℃，相對濕度30%～60%，噪聲 ≤ 60 dB，光照強(qiáng)度1001x～1501x。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滇)K2013-0001，實(shí)驗(yàn)操作在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行,使用許可證號(hào)SYXK(滇)K2013-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑耗材

Forma A/B3(6Ft)生物安全柜，F(xiàn)orma CO2T/C 恒溫培養(yǎng)箱，尼康Ti倒置顯微鏡，HDR-PJ10E 攝像機(jī)，L8-80 M 超速離心機(jī)，ZD-85 雙功能氣浴振蕩器， BS100S 電子天平，TOMY-SS-325 高壓滅菌鍋；PBS(購自Thermo)，DMEM/F12 培養(yǎng)基(購自Gibco)，F(xiàn)BS(購自Hyclone)，胰蛋白酶(購自Gibco)，抗Ⅷ因子抗體(購自Millipore)，膠原酶XI，中性蛋白酶II，BSA(購自BIOSHARP)，NunclonTMSpheraTMT25培養(yǎng)瓶(購自Thermo)。

1.3 方法

1.3.1樹鼩主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離

1.3.1.1 組織塊培養(yǎng)法：取新生兩日齡樹鼩，注射過量2% 戊巴比妥鈉處以安樂死，用無菌剪取胸主動(dòng)脈，在顯微操作臺(tái)下仔細(xì)去除血管外結(jié)締組織和脂肪，用眼科剪將血管延縱向剪開；在超凈工作臺(tái)上用含2% 雙抗的HBSS溶液清洗血管3次；無菌剪將血管剪碎，約1 mm3大??；用眼科鑷將組織塊夾入T25 培養(yǎng)瓶中；組織塊均勻放好后將瓶底朝上，向瓶內(nèi)注入適量含10%新生牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基；放置1 h，待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.1.2 胰蛋白酶、膠原酶連續(xù)消化法：主動(dòng)脈組織碎塊獲得過程參照1.3.1.1，組織塊中加入5 mL 0.125%胰蛋白酶消化液，置于氣浴振蕩器37 ℃消化 15 min；消化產(chǎn)物中加入等體積的含10%新生牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化；1 200 r/min 離心5 min；棄上清；加入5 mL含75 U/mL膠原酶XI、20 μg/mL中性蛋白酶II、0.5 m mol/L二硫蘇糖醇(DTT)的DMEM/F12消化液；置于孵箱 37 ℃ 180 r/min 搖動(dòng)消化1 h；1 200 r/min離心5 min；棄上清；加入4 mL 完全培養(yǎng)基重懸接種于T25細(xì)胞瓶，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每隔2 d換一次液。

1.3.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：用倒置顯微鏡對培養(yǎng)的原代VECs進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

1.3.3細(xì)胞傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)約 10～12 d，顯微鏡觀察到細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的 2/3 以上，約80% 的細(xì)胞匯合即可傳代。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2～3次，加入1 mL 0.125% 胰蛋白酶消化，約1 min,見內(nèi)皮細(xì)胞收縮變圓，立即加入等體積的含10% 新生牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打混勻，1 500 r/min 離心 5 min，棄上清，加入2 mL含10% 新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，依照細(xì)胞的量按1∶2或1∶3傳代培養(yǎng)，隔天換液 1次。

1.3.4Ⅷ因子免疫熒光染色：取24孔板，在中間8個(gè)孔中加入細(xì)胞爬片，并將第2代細(xì)胞接種于孔中；將孔板中已爬好細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min；吸干PBS，在玻片上滴加1% BSA，室溫封閉30 min；吸掉封閉液，滴加按1∶500稀釋的抗Ⅷ因子一抗，對照孔加PBS代替一抗，4 ℃過夜孵育；PBS浸洗爬片3次，每次3 min；避光加入熒光二抗，37 ℃孵育箱1 h；PBS浸洗爬片3次，每次3 min；吸干爬片上多余液體后，滴加DAPI避光孵育3 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS清洗3次,每次3 min，洗去多余的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

圖1 分離得到的樹鼩血管內(nèi)皮細(xì)胞注：A、B中黑色團(tuán)塊為貼壁的血管組織塊。A: 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)3 d，部分細(xì)胞貼壁生長(×100)； B: 組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)6 d(×100)；C:組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)15 d，細(xì)胞匯合 (×100)；D：酶消化法所得VECs培養(yǎng)第3 d(×100)；E：酶消化法所得VECs培養(yǎng)第6 d(×100)；F:酶消化法所得VECs培養(yǎng)第12 d，細(xì)胞匯合成單層(×100)。(標(biāo)尺：100 μm)Fig.1 Isolated VECs from tree shrewNote: The black clumps in Figures A and B represent adherent vascular tissue blocks.A: Tissue culture was cultured for 3 days,and some cells adhered to the wall (×100). B: Tissue culture method for 6 days (×100); C: Tissue culture method for 15 days,cell confluence (×100); D: VECs were obtained by enzymatic digestion for 3 days (×100); E: VECs were obtained by enzymatic digestion for 6 days (×100)；F: VECs were obtained by enzymatic digestion for 12 days, cells are aggregated into monolayers (×100).(Scale:100 μm)

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)1周內(nèi)細(xì)胞貼壁較少，生長緩慢，7 d后細(xì)胞從團(tuán)塊中大量長出且細(xì)胞生長狀況良好。酶消化法所得細(xì)胞12 h即貼壁，3～7 d生長較快。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，呈短梭形或多角形，12～15 d匯至成單層細(xì)胞，密度不勻，胞核清晰，胞漿豐富，呈現(xiàn)VECs典型的“鋪路石”狀(圖 1)。

2.2 免疫熒光染色

Ⅷ因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志性抗原，用抗Ⅷ因子的一抗進(jìn)行免疫熒光染色后，兩種方法所得細(xì)胞均可被染成綠色，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，而陰性對照無特異性染色(圖 2)

圖2 血管內(nèi)皮細(xì)胞VIII因子熒光染色結(jié)果注:A:Ⅷ因子陽性表達(dá)(×100)； B:DAPI染核(×100)； C:合并A、B(×100)。(標(biāo)尺:100 μm)Fig.2 Vascular endothelial cell factor VIII staining resultNote:A:Factor Ⅷ positive expression (×100); B: Nucleus stained by DAPI(×100); C: Merge A and B(×100).(Scale:100 μm)

3 討論

目前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)多為組織塊貼壁法[5-6]和酶消化法[7]，此外，還見到有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道將血管內(nèi)壁外翻法[8]進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。血管內(nèi)壁外翻法有一個(gè)很大的優(yōu)勢，即減少了平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染，這對于本身材料有限的情況下，確保了能夠獲得高純度的細(xì)胞分離產(chǎn)物；但不利之處是由于細(xì)胞長時(shí)間暴露在環(huán)境中，最終活力可能會(huì)受到影響。由于本實(shí)驗(yàn)材料來自于幼齡樹鼩，體型十分小，其主動(dòng)脈管徑也相當(dāng)小，給血管內(nèi)壁外翻法分離培養(yǎng)帶來了很大的困難，同時(shí)需要在顯微操作臺(tái)下進(jìn)行操作，技術(shù)要求高。

實(shí)驗(yàn)前期，我們曾嘗試采用血管內(nèi)壁外翻法來進(jìn)行細(xì)胞分離，可最終未能成功。最終選擇組織塊培養(yǎng)法和酶消化法來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩種方法均可獲得原代血管內(nèi)皮細(xì)胞。取材后只需要在顯微鏡下仔細(xì)去除血管外部多余組織，然后馬上進(jìn)入消化步驟，節(jié)省了時(shí)間。而且最終分離獲得的細(xì)胞受成纖維細(xì)胞等的污染很小，完全可以考慮后期用差速貼壁和差速消化法甚至是密度梯度離心來去除污染。組織塊培養(yǎng)法分離獲得單層細(xì)胞周期較酶消化法長，且存在部分成纖維細(xì)胞。酶消化法消化下的細(xì)胞少，但貼壁快，匯合為單層周期短，且細(xì)胞均一。所以從實(shí)驗(yàn)操作來看，采用酶消化法來分離細(xì)胞既簡便又高效。

本研究中動(dòng)物是出生兩日齡樹鼩，相比于成年樹鼩，分離得到的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力應(yīng)該更好，傳代次數(shù)也應(yīng)該更高。這對于本實(shí)驗(yàn)室后期將要進(jìn)行的病毒感染性實(shí)驗(yàn)帶來了很大的優(yōu)勢。樹鼩作為人類近親，相比其他非人靈長類動(dòng)物體型更小，繁殖周期更短等優(yōu)點(diǎn)。此前李曉飛等[9]和王文廣等[10]已利用樹鼩開展了病毒相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。所以，建立其血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法，為該細(xì)胞相關(guān)的病毒感染[11-13]、信號(hào)通路、代謝、腫瘤[14]等研究帶來了便利。