王永菲 于 偉 朱曉偉

(1. 內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，呼和浩特 010110)(2. 遼寧省疾病預防控制中心， 沈陽 110005)

最新統(tǒng)計顯示，手足口病是世界范圍內常見的兒童流行傳染病，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹或皰疹為主要特征。手足口病可由20多種病毒感染引起，其中柯薩奇A組16型和人腸道病毒71型是主要病原體。 人腸道病毒71型(Human Enterovirus71， HEV71)感染5歲以下的兒童導致 手足口病時，會出現(xiàn)比較嚴重的并發(fā)癥，包括呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥(如急性肺水腫、急性肺出血甚至發(fā)展為心肌炎等)和神經系統(tǒng)并發(fā)癥(如腦干腦炎、無菌性腦膜炎和類脊髓灰質炎樣麻痹等)[1-2]，預后不良，因此對 HEV71型的研究就較多較深入； 而柯薩奇A組16型(Coxsackievirus A16，CVA16)兒童感染后通常不引起嚴重的中樞神經相關的疾病，因此對CVA16型的研究較少，但近幾年越來越多的研究表明，CVA16感染與心肌炎、心包炎及其他嚴重疾病相關[3]，尤其在我國自主研發(fā)的HEV71疫苗上市后，兒童可以通過預防接種達到90%以上的免疫保護，因此在臨床上CVA16型相較而言成為了引起兒童手足口病的主要病原體。盡管因感染CVA16而引起的重癥患者沒有HEV71多，但是由于感染CVA16型而導致的手足口病患者的數量并不是少數，基本上占患者總數的三分之一左右，由此引發(fā)的醫(yī)療的投入還是相當可觀的，所以對CVA16的分離及檢定也需要加以重視。

病原分離是疫情判定的金標準，而對于病毒病來說想要分離到病原，其中最重要的是要篩選到敏感的細胞系[3-4]。本研究將核酸檢測CVA16為陽性的標本，分別在二種細胞系中進行病毒分離，通過統(tǒng)計不同細胞系的分離率來比較不同細胞對陽性樣本的敏感性，從而確定腸道病毒CVA16的最敏感細胞，建立快速準確的病毒分離方法，為臨床的對癥治療提供依據，而且通過對病毒的變異分析，為制定有效防控兒童手足口病措施提供有力的科學依據。

1 材料與方法

1.1 標本的采集和處理

隨機抽取遼寧各市送的手足口病臨床診斷患者咽拭子標本20份，化凍后每個標本分為3份，分別裝在3支凍存管中。1支用于核酸提取并進行Real-time PCR 檢測，一支用于實驗室備查留樣，另一支用于細胞篩選病毒分離，后二支樣品放置于-70 ℃冰箱凍存。

1.2 病毒分離鑒定

選取二種細胞進行病毒分離，分別是人橫紋肌肉瘤細胞(RD)、非洲綠猴腎細胞(VERO)，細胞均為遼寧省疾病預防控制中心細胞庫保存。MEM為美國Gibco/Life technologies公司生產；胎牛血清、0.25%胰酶及雙抗均為以色列Biological Industries公司生產。每份標本在二種細胞上至少傳三代，如果出現(xiàn)致細胞病變效應(CPE)，則判為陽性；如果不出現(xiàn)CPE，則判定為陰性。無論是否有CPE出現(xiàn)，均將所有病毒培養(yǎng)液全部收集，使用熒光定量PCR(Real-time PCR)方法進行下一步鑒定。

1.3 病毒核酸提取

實驗采用 QIAGEN 公司的EZ1 Advanced XL 全自動核酸提取儀，使用EZ1 Virus Mini Kit V2.0(Cat. No.955134)進行核酸提取，具體步驟參考其說明書。

1.4 病毒核酸檢測

將提取的核酸應用Real-time PCR檢測方法，擴增反應體系配備和條件按照說明書操作和設置。檢測試劑盒為江蘇碩世公司的腸道病毒通用型核酸監(jiān)測試劑盒(熒光PCR法)及江蘇碩世公司的柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)；PCR儀為ViiATM7熒光定量PCR。

2 結果

2.1 標本的核酸檢測結果

2.1.1對20份標本腸道病毒用通用型核酸監(jiān)測試劑盒(熒光PCR法)進行腸道病毒通用型檢測，試劑盒中自帶質控參考品，包括陰性參考品和陽性參考品，結果判定標準是：陽性，CT≤35且曲線呈S型；陰性，CT>38或者未檢出。檢測結果如下：

如圖1，顯示21條典型的S型陽性曲線，其中所示1條為陽性對照，其余20條均為陽性標本，所抽取的20份標本的 CT值小于35，可以確定此次標本全部為腸道病毒陽性標本。 這20份標本是各市所送的陽性標本，此結果與各市的檢測結果完全一致。

2.1.2對腸道病毒陽性的標本用柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)進行CVA16型檢測，試劑盒中自帶質控參考品，包括陰性參考品和陽性參考品，結果判定標準是：陽性，CT≤35且曲線呈S型；陰性，CT>38或者未檢出，檢測結果如下：

如圖2，顯示10條典型的S型陽性曲線，其中所示1條為陽性對照，其余9條均為陽性標本，9份標本的CT值小于35，可以確定為腸道病毒CVA16陽性標本，其他的11份標本為非CVA16的腸道病毒陽性標本。

圖1 所抽取的 20份標本的腸道病毒通用型Real-time PCR檢測結果Fig.1 Detection of 20 specimens by universal enterovirus Real-time PCR

圖2 標本編號01、04、05、09、10、13、14、17、20的腸道病毒CVA16型Real-time PCR檢測結果Fig.2 01、04、05、09、10、13、14、17、20 specimens by enterovirus CVA16 Real-time PCR

2.2 病毒分離

實驗選用了二種細胞進行病毒分離，分別是人橫紋肌肉瘤細胞(RD)、非洲綠猴腎細胞(VERO)，將9份確定的陽性標本分別接種到細胞中，每個陽性樣本在二種細胞上至少傳三代， RD細胞中4份標本出現(xiàn)了明顯的CPE，可觀察到細胞變圓、皺縮至脫落的病變，5份樣本沒出現(xiàn)病變；VERO細胞中有8份標本出現(xiàn)了明顯的 CPE，可觀察到細胞腫脹、變圓、聚集成葡萄串狀的病變，1份樣本沒出現(xiàn)病變。僅就細胞病變而言，發(fā)生病變的VERO細胞與正常的VERO細胞在形態(tài)上有很大的改變，更直觀、更便于觀察；RD細胞的細胞病變不易觀察，其病變與細胞衰老的狀態(tài)相似，需要仔細辨別和經驗積累。

圖3 左圖為正常Vero細胞，右圖是出現(xiàn)CVA16陽性標本病變的Vero細胞Fig.3 The left image is normal Vero cell,the right picture is Vero cell with CVA16

圖4 左圖為正常RD細胞 右圖是出現(xiàn)CVA16陽性標本病變的RD細胞Fig.4 The left image is normal RD cell,the right picture is RD cell with CVA16

2.3 病毒培養(yǎng)液的核酸檢測結果

當實驗進行到陽性樣本在細胞上培養(yǎng)三代時，分別抽取病毒培養(yǎng)液，用柯薩奇病毒A16型核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)進行CVA16型檢測，試劑盒中自帶質控參考品，包括陰性參考品和陽性參考品，結果判定標準是：陽性，CT≤35且曲線呈S型；陰性，CT>38或者未檢出，檢測結果如下：

如圖5，顯示共有15條典型的S型陽性曲線，其中1條為陽性對照，其余14條為陽性病毒培養(yǎng)液，這14條曲線的 CT值均在20左右小于35，可以確定為CVA16病毒陽性。RD細胞的病毒培養(yǎng)液，6份標本結果為陽性，其中2份為細胞培養(yǎng)沒出現(xiàn)明顯的CPE的標本的結果也是陽性，其余3份標本結果為陰性；VERO細胞的病毒培養(yǎng)液，8份標本結果為陽性，1份標本結果為陰性。以上結果表明用 RD細胞分離CVA16時，需要將全部病毒培養(yǎng)液進行核酸檢測，才能確保沒有遺漏的陽性病毒液；而用VERO細胞分離CVA16時，只需要認真觀察細胞病變就可以判定是否為陽性，這樣不僅節(jié)省了試劑，也減少了實驗人員的工作量。

圖5 病毒培養(yǎng)液的Real-time PCR檢測結果Fig.5 Detection results of Real-time PCR in virus culture fluid

3 討論

自從1951年在南非分離到CVA16以來，其流行范圍已遍布全球。不同基因型或基因亞型的HFMD交替爆發(fā)于東亞和東南亞地區(qū)[5-6]。從遼寧省各年檢測的HFMD 送檢樣本結果可知，近幾年來遼寧省HFMD 主導病原型別存在交替變化，2012 年、2014 年、2016 年HFMD 主導病原學型別以CVA16 為首[7-8]，分別占當年檢測陽性數的50%左右；2013 及2015 年HFMD 主導病原學型別以其他腸道病毒為首，分別占當年檢測陽性數的50%左右。從這組數據可以看出，CVA16型作為遼寧省近幾年手足口病的優(yōu)勢株，對遼寧省兒童健康造成的危害還是不容小覷的。

分離毒株主要是為了基因序列測定分析等相關研究，而能夠引起手足口病的腸道病毒有20多種，不同的病毒對不同細胞系的敏感性不盡相同，為了獲得更多型別的腸道病毒，我們要采用盡可能多的細胞系進行病毒分離，來獲得更多的毒株進行研究，以便能夠更真實地了解當地手足口病的病原譜[9-12]。同時一種病毒對不同的細胞系的敏感性也不同，我們也要采用盡可能多的細胞系進行病毒分離，從中確定其最敏感的細胞系，以提高病毒的分離率，降低分離成本。

本實驗選取二種細胞對腸道病毒CVA16型進行分離：人橫紋肌肉瘤細胞(RD)、非洲綠猴腎細胞(VERO)。結果表明在VERO細胞上腸道病毒CVA16型敏感性最高，而且在 VERO細胞上病變明顯，容易直接觀察到，可以根據所觀察到的 CPE進行核酸檢測，基本上不會漏檢；其次是 RD細胞，但CVA16型在 RD細胞上病變不明顯，病變與細胞老化非常接近，所以在觀察細胞病變時不僅要及時還要有一定的工作經驗，否則要全部進行核酸檢測，增加病毒分離及鑒定的成本。綜上所述，VERO細胞和RD細胞均是腸道病毒CVA16的敏感細胞，但RD細胞如果僅憑CPE判斷容易發(fā)生漏檢，而且其敏感性也不如VERO細胞，因此我們認為VERO細胞是分離腸道病毒CVA16型的首選細胞。

現(xiàn)階段手足口病毒的細胞篩選多選用VERO細胞和RD細胞，這兩種細胞都是傳代細胞，具有易培養(yǎng)、生長快的優(yōu)點[13-14]。RD細胞是人橫紋肌肉瘤細胞，本身具有致腫瘤性，不能用于疫苗的生產；VERO細胞是非洲綠猴腎細胞，在有限的代次內無致腫瘤性，在國內已經被廣泛應用于疫苗生產。手足口病 HEV71型疫苗就是以VERO細胞為培養(yǎng)基質研制成功的，但國內尚未有比較CVA16型病毒的細胞敏感性的研究，通過本研究可以初步確定CVA16型對VERO細胞也較敏感，那么可以推測未來CVA16型疫苗也可能通過這種模型取得成功，如果該種疫苗研制成功，將會同 HEV71型疫苗一起有效地降低兒童手足口病的發(fā)病率。