練高建 楊神書 何理平 尹倩梅 譚翔文 吳端生 蘇澤紅

(1.南華大學實驗動物學部，衡陽 421001)(2.南華大學藥學與生物科學學院生物科學系，衡陽 421001)

人類多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)是以中樞神經系統(tǒng)慢性炎性浸潤，脫髓鞘，軸突損害及腦萎縮為主要特征的一種復雜基因疾病。很多研究證明MS的發(fā)生具有很強的基因背景[1-3]；自身的激活反應性T細胞也參與調節(jié)多發(fā)性硬化癥的病理生理學進程。目前光學相干斷層成像掃描技術(optical coherence tomography, OCT)已應用于MS病理組織觀察[4]，但MS的發(fā)病機理仍不清楚。

實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(Experimental Allergic Encephalomyelitis, EAE)是由針對CNS髓鞘發(fā)生免疫攻擊的CD4+T細胞介導的自身免疫性疾病，抗原致敏的T細胞穿過血腦屏障進入中樞，誘發(fā)對自身髓鞘抗原的免疫應答，導致腦及脊髓的免疫損傷。EAE是人類MS的經典模型，通過對EAE發(fā)病機制、病情發(fā)生發(fā)展規(guī)律、臨床及病理改變、治療及預防等方面的深入研究，可為MS的治療提供充分的實驗依據(jù)[5]。

因此，本文以C57BL/6小鼠為實驗對象，在國內外使用的方法基礎上加以改進，成功建立起病程穩(wěn)定、發(fā)病率高的EAE模型，為研究人類MS的發(fā)病機理及篩選有效的臨床防治藥物提供可靠的小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級7～9周雄性C57BL/6小鼠(16～20 g)，購自南華大學實驗動物學部。所有小鼠均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，隨機分為EAE模型組和實驗對照組，每組10只。

1.2 試劑

髓鞘少突膠質細胞糖蛋白MOG35-55多肽(Myelin Oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55 peptide)購自上海信裕生物科技有限公司，預先用PBS配制成10 mg/mL，儲存于-20 ℃，工作濃度：0.5 mg/mL。百日咳毒素(已滅活)(Pertussis toxin, PTX)購自北京博蕾德生物科技有限公司，預先用PBS配制成100μg/mL，儲存于-20 ℃，用前用PBS稀釋100倍，腹腔注射0.2 mL/只。結核分支桿菌(已滅活)(Mycobacteriumtuberculosis, MT)購自西寶生物科技(上海)股份有限公司。不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s Adjuvant，IFA)，購自北京索萊寶科技有限公司，預先準備4 mg/mL MT-IFA混合液：80 mg 結核分支桿菌與20 mL不完全弗氏佐劑充分混勻后，轉移至50 mL玻璃勻漿器，按照10 min反復研磨，然后置于冰上10 min的節(jié)奏，至少重復3遍以上(注意：準備時應戴上口罩)。

MOG33-35與MT-IFA混合液的準備：先用一支注射器吸取0.5 mg/mL的MOG33-35工作液，另一支注射器吸取與MOG33-35工作液等體積的MT-IFA工作液，小心地去除2支注射器中的空氣后，用3向旋塞閥連接2支注射器(根據(jù)混合體積選擇合適的注射器)，反復抽打5 min，然后置于-20 ℃ 5～10 min，如此反復3次以上直至形成混合良好的油包水型乳化劑。

1.3 EAE的構建

將小鼠麻醉后，先以0.2 mL/只小鼠的劑量腹腔注射準備好的1 μg/mL的百日咳毒素工作液，然后每只小鼠注射0.2 mL上述方法準備好的MOG-MT-IFA抗原混合液，背部約前肢肩胛骨及后肢髖關節(jié)部位分4點皮下注射各50 μL。于48 h后再每只小鼠分別腹腔注射1μg/mL的百日咳毒素工作液0.2 mL。對照組小鼠僅注射PBS。

1.4 EAE進程監(jiān)測及臨床癥狀分級

自第2次注射百日咳毒素后，每日觀察小鼠狀態(tài)。采用雙盲法，按照Goverman等[6]提出的標準判斷小鼠發(fā)病程度：0分，小鼠各項指標正常；1分，尾無力及下垂；2分，步態(tài)不穩(wěn)，人為翻身后不能迅速復位；3分，后肢無力或單側后肢癱瘓；4分，后肢拖行，完全癱瘓；5分，后肢完全癱瘓伴隨前肢無力或癱瘓。

1.5 取材及組織學分析

EAE小鼠發(fā)病至高峰期，用異氟烷深度麻醉小鼠，打開小鼠胸腔，用注射器經左心室灌注PBS至肝臟發(fā)白，取出脊髓，用10%多聚甲醛固定，6 μm石蠟切片，經常規(guī)蘇木素-伊紅(H&E)染色，或神經髓鞘固藍(Luxol fast blue,LFB)/過碘酸雪夫氏(Periodic Acid-Schiff, PAS)雙重染色，或免疫組織化學染色后，光鏡下觀察分析炎性細胞浸潤，脫髓鞘狀況及鑒定浸潤炎性細胞類型。

2 結果

2.1 EAE發(fā)生發(fā)展情況

自抗原免疫后第10天起，EAE實驗組小鼠開始陸續(xù)出現(xiàn)EAE臨床癥狀，至15 d達到發(fā)病高峰，發(fā)病率達到100%。EAE實驗組小鼠發(fā)病后表現(xiàn)為：行動遲緩，活動減少，食欲下降伴隨體質量減輕，身體狀態(tài)明顯差于對照組小鼠。臨床癥狀則隨時間的推移逐漸加重，具體表現(xiàn)為：從尾巴松弛下垂開始，至步態(tài)搖擺、人為翻身不能自主快速復位，再進至單側后肢癱瘓、雙后肢癱瘓，最終發(fā)展為四肢癱瘓。 而對照組所有動物至實驗結束時表現(xiàn)正常，狀態(tài)良好，未出現(xiàn)發(fā)病情況，且小鼠體質量正常增加。按照動物福利規(guī)定要求，我們的實驗最高評分為4分，動物達到4分標準后即麻醉處死取材分析。實驗結果如圖1。

圖1 C57BL/6小鼠神經功能評分Fig.1 Neural function score of C57BL/6 mice

2.2 HE 結果

小鼠腦脊髓組織HE染色結果顯示，模型組(圖2 A)中出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤，尤其以腰部脊髓炎性細胞浸潤最為嚴重。而正常對照組(圖2B)則未發(fā)生炎性細胞浸潤。

圖2 HE 染色顯示脊髓炎性細胞浸潤 (×100)注： A. EAE組；B. 正常對照組Fig.2 Inflammatory cells infiltration in spinal cord, HE staining (×100)Note：A. EAE group; B. Control group

2.3 免疫組織化學結果

為進一步確定浸潤的炎性細胞的類型，我們分別進行了淋巴細胞及巨噬細胞的免疫組化染色反應研究，結果顯示，模型組浸潤的炎性細胞中，少量為淋巴細胞，大部分為巨噬細胞(圖3A)，而正常對照組(圖3B)則沒有出現(xiàn)任何炎性細胞浸潤。

圖3 免疫組化反應顯示脊髓中浸潤細胞類型 (×100)注：A. EAE組；B. 正常對照組Fig.3 Inflammatory cells infiltration in spinal cord, Immunohistochemistry assay (×100)Note：A. EAE group; B. Control group

2.4 LFP/PAS 雙重染色結果

為同時表現(xiàn)炎性細胞浸潤及脫髓鞘病理變化，我們進行了LFP/PAS雙重染色反應，結果顯示，模型組出現(xiàn)明顯的細胞浸潤和脫髓鞘病理改變(圖4中箭頭所示)，而正常對照組則無此現(xiàn)象發(fā)生。

圖4 神經髓鞘固藍(LFB)/過碘酸雪夫氏(PAS)雙重染色顯示脊髓中炎性細胞浸潤及脫髓鞘狀況 (×100)注： A. EAE組；B. 正常對照組Fig.4 Inflammatory cells infiltration and demyelination in spinal cord, LFB/PAS double staining (×100)Note：A. EAE group; B. Control group

3 討論

雖然至今仍然未能闡明MS的發(fā)病機理，但大量的研究表明，髓鞘特異性的TH17細胞過度的免疫反應以及具有免疫耐受作用的調節(jié)性T細胞的功能紊亂，在MS的病理進程中扮演了重要角色。TH17 cells 對中樞神經系統(tǒng)的浸潤和在外周免疫器官的累積，及其特征性細胞因子-IL-17通過不同的作用機制也對MS及EAE的病理進程起了極大的作用[7-8]。因此，建立起能準確模擬MS發(fā)病過程并具有類似臨床表現(xiàn)的動物模型，能為闡明MS的發(fā)病機制及篩選防治MS的有效藥物打下堅實的基礎。

不同品種或同一品種不同品系動物對EAE的易感性主要受免疫反應基因(Ir基因)影響，Ir基因的調節(jié)作用表現(xiàn)為T細胞表面受體對髓鞘堿性蛋白(MBP)的特異性表達。動物的種類不同，其受體表達能力不同，對自身抗原的反應性不同，因而對EAE的易感性也不同，因此在選擇動物時需要尋找EAE敏感的模型動物。 鑒于對EAE敏感的Lewis、DA大鼠，PL/J，SJL/J小鼠的價格昂貴、不易獲得且難以飼養(yǎng)，國內多采用廉價易得的Wistar大鼠，但其敏感性不及前者。本研究中我們選用的C57BL/6小鼠，在國內應用十分廣泛，且遺傳背景明確并早已標準化繁育，使用起來非常方便且價格便宜，得到的實驗結果準確、可靠。比較起目前國內常用的Wistar大鼠，操作起來也更為容易。

本實驗采用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白MOG35-55多肽與結核分支桿菌及不完全弗氏佐劑充分混勻、乳化制成免疫原，以加強免疫原性并延長抗原在小鼠體內的停留時間，從而充分誘導免疫反應，同時結合2次腹腔注射百日咳毒素，以利于炎性細胞穿過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，成功建立起的EAE小鼠模型，不僅模型穩(wěn)定，病理上則表現(xiàn)出炎性細胞浸潤，尤其是以巨噬細胞浸潤為主，并出現(xiàn)明顯的脫髓鞘現(xiàn)象，這些表現(xiàn)均與人類多發(fā)性硬化癥極為相似。而且發(fā)病率高達100%，從而在實驗中可以排除模型構建成功與否對實驗結果的干擾，方便對所篩選的藥物是否有效或療效如何作出準確判斷。因此，值得在今后的研究中進一步探討，并將其應用于MS發(fā)病機理及預防治療的課題研究中。