董 敏 梁 磊 尤金煒 馬 暢 張旭亮 惲?xí)r鋒

(南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實驗動物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002)

實驗動物福利是動物實驗研究的重要組成部分[1]。福利受損不僅可引起實驗動物機體內(nèi)環(huán)境的變化，而且可導(dǎo)致實驗動物出現(xiàn)毛色、精神狀態(tài)的改變，甚至行為異常，影響實驗結(jié)果。動物福利評估是保障實驗動物福利的重要方法[1-2]。

評價實驗動物福利水平的方式有多種，但目前尚無特異性指標(biāo)和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。以往研究多利用基礎(chǔ)生理生化或內(nèi)分泌等方面的指標(biāo)進行評估，而研究行為學(xué)數(shù)據(jù)同時觀測NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達的報道較少[2-4]。

本實驗以常見的SD大鼠為研究對象，以束縛制動致其福利受損，通過經(jīng)典的行為學(xué)方法“曠場實驗”和“O迷宮”，觀察了制動致福利受損大鼠部分行為學(xué)改變，同時對大鼠肝細胞內(nèi)NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量約200 g，由南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供[SCXK(軍)2012-0014]，使用許可證[SYXK(軍)2012-0047]。60Co滅菌全價顆粒飼料與高溫高壓滅菌飲用水，自由采食。

1.1.2主要儀器和試劑:冰凍離心機(Heal Force，Neofuge 15R)，Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies，15596-026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，#K1622)，PCR儀(ABI，Step One Plus)，熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Roche LightCyclery 96)動物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology，Etho Vision XT，The Netherlands)；一抗HRP標(biāo)記山羊抗兔(武漢谷歌生物科技有限公司，GB23303)、二抗HRP標(biāo)記驢抗山羊(武漢谷歌生物科技有限公司，GB23404)、Protein Marker(Thermo，26616)，Acr、Bis、Tris、TWEEN 20(Solarbio)，PVDF膜(Millipore)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1實驗處理: 48只SD大鼠給予管狀容器制動，每日固定時間上、下午各1 h，并于制動的第0、1、3、7、10、14天隨即抽取8只動物進行曠場和O迷宮實驗。實驗后取材，用于指標(biāo)測定。其中第0天的8只動物未束縛刺激，作為空白對照，每次抽樣檢測樣本量n=8[5]。

1.2.2指標(biāo)測定

1.2.2.1 實時熒光定量PCR檢測肝細胞NF-κB p65 mRNA相對含量：取大鼠肝臟組織，充分裂解后按Trizol操作說明提取總RNA。而后按照Thermo#K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，每管加入總RNA 4μg，37℃反應(yīng)1 h，70℃15 min。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于實時定量PCR反應(yīng)，引物(Invitrogen Biotechnology Co., LTD提供)為：p65上游引物 5′-AAGCACAGATA CCACCAAGACAC-3′，下游引物 5′-CGCACTGCATTC AAGTCATAGTC-3′，擴增片段長度324 bp，退火溫度60℃；GAPDH上游引物 5′-GTGACGTTG ACATCCGTAAAGA-3′，下游引物 5′-GTAACAGTCC GCCTAGAAGCAC-3′，擴增片段長度287 bp，退火溫度60℃。

反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，加入Nuclease-Free Water至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s)×40個循環(huán)，每個樣品3次重復(fù)。將空白組大鼠基因表達水平定為1，比較其他組別的基因表達差異。

1.2.2.2 Western blot檢測肝細胞NF-κB p65蛋白表達：取肝臟組織，裂解細胞提取總蛋白。10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃反應(yīng)1 h，洗膜ECL顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，每組樣本進行3次重復(fù)，以p65蛋白條帶灰度與對應(yīng)GAPDH條帶灰度的比值顯示p65蛋白的表達水平。

1.2.2.3 曠場實驗(Open-field Test)：參照王少華和吳凡等的實驗方法[6-7]。曠場為不透明材料制成的箱式容器，尺寸為50 cm×50 cm×30 cm，箱底劃分為等面積的25個正方形方格，四周有高30 cm的黑色周壁，無頂。實驗時光照設(shè)置為黑夜模式，背景噪聲控制在65 dB以下，從同一位置將大鼠放入中央格，采用動物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄每只大鼠10 min內(nèi)的行進總路程、平均速度、中央活動路程及中央活動時間。每檢測一只大鼠后使用酒精清理實驗箱，避免遺留糞便、氣味等影響后續(xù)實驗。

1.2.2.4 O迷宮(Elevated O-maze Test)：高架O迷宮實驗參照文獻[8]。實驗時將大鼠面對閉臂區(qū)間放置于開臂區(qū)間與閉臂區(qū)間的接點處，記錄5 min內(nèi)大鼠進入開臂區(qū)間的次數(shù)及停留時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外觀比較

實驗初期，大鼠進食正常，雙目有神，反應(yīng)靈敏，毛色柔順光亮。隨著實驗進行，大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的反應(yīng)遲鈍，易怒，攻擊性增強，毛色雜亂暗沉。

2.2 NF-κB p65 mRNA 轉(zhuǎn)錄

實時熒光定量PCR目的基因NF-κB p65和內(nèi)參GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，引物擴增效率為99.6%。結(jié)果如圖1所示，隨著束縛時間的延長，SD大鼠肝細胞NF-κB p65的mRNA水平逐漸升高，從束縛3 d開始即顯示出顯著差異(P<0.05)，至束縛14 d時，與束縛前比較，差異已極其顯著(P<0.01)。

圖1 不同束縛時間大鼠肝細胞NF-κB p65基因表達注：*表明與束縛前比較，*P<0.05，**P<0.01 (n=8)Fig.1 Gene expression of NF-κB p65 in liverNote: *means compare with mock group,*P<0.05，**P<0.01 (n=8)

2.3 NF-κB 蛋白表達

結(jié)果如圖2所示。對各個組別的相對灰度比值進行了統(tǒng)計分析后，表明第3、7、10、14天的NF-κB p65蛋白表達顯著高于束縛前(P<0.05)，其中第14天的蛋白表達差異極其顯著(P<0.01)。

表1 大鼠曠場實驗結(jié)果Table 1 Open-field test result

注：*表示與空白比較，*P<0.05；^表示與束縛1 d比較，^P<0.05；#表示與束縛3 d比較，#P<0.05；□表示與束縛7 d比較，□P<0.05(n=8)

Note：Compare with control,*P<0.05；Compare with restrain 1d,^P<0.05；Compare with restrain 3d,#P<0.05；Compare with restrain 7d,□P<0.05 (n=8)

圖2 不同束縛時間大鼠肝細胞NF-κB p65蛋白表達注：*表明與束縛前比較，*P<0.05，**P<0.01 (n=8)Fig.2 Protein expression of NF-κB p65 in liverNote: * means compare with mock group,*P<0.05，**P<0.01 (n=8)

2.4 曠場實驗

結(jié)果如表1所示，束縛1至7 d，SD大鼠的活動性與束縛前相比均出現(xiàn)不同程度的降低，同時隨著束縛時間的增加，活動性的降低情況逐漸加重，但尚未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異。束縛10、14 d時，大鼠的活動性降低情況愈加嚴(yán)重，并表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。

2.5 O迷宮實驗

結(jié)果如表2所示，大鼠經(jīng)束縛10 d至14 d后，在迷宮中的行進速度開始與束縛1至7 d產(chǎn)生差異(P<0.05)。束縛1 d后，大鼠進入開臂的時間即顯著縮短(P<0.05)，束縛10 d以上后，差異與空白組相比已極其顯著(P<0.01)，同時也與其他束縛組產(chǎn)生差異(P<0.05)；同樣,大鼠停留于開臂的時間，經(jīng)束縛1 d后即產(chǎn)生差異(P<0.05)，并隨束縛時間增加而逐步減少，同時差異性變化也更為顯著。

表2 大鼠O迷宮實驗結(jié)果Table 2 Elevated o-maze test Result

注：*表示與空白比較，*P<0.05,**P<0.01；^表示與束縛1 d比較，^P<0.05；#表示與束縛3 d比較，#P<0.05；□表示與束縛7 d比較，□P<0.05 (n=8)

Note：Compare with control,*P<0.05,**P<0.01；Compare with restrain 1d,^P<0.05；Compare with restrain 3d,#P<0.05；Compare with restrain 7d,□P<0.05 (n=8)

3 討論

利用基礎(chǔ)生理生化、內(nèi)分泌、免疫學(xué)等指標(biāo)對動物福利水平進行評估是目前最常用的福利評估方法[3]，但由于在采集這些數(shù)據(jù)的過程中，創(chuàng)傷等各類操作會不同程度刺激實驗動物，造成動物福利受損，同時導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)誤差[3-4]。而利用實驗動物行為學(xué)數(shù)據(jù)的評估方法不僅具有便捷、可靠的優(yōu)點，還能避免上述問題。另外，前述有創(chuàng)刺激評價方法在進行檢測時動物福利已然受損、靶器官已受損害，動物健康或?qū)嶒灲Y(jié)果已發(fā)生不可逆影響。而行為學(xué)的評價能否在福利受損早期觀察出動物的變化而進行干預(yù)，尚不得而知。近幾年來，梁磊等[5]利用NF-κB 的檢測對動物福利早期受損進行評估，取得了較好的效果，本文利用動物制動術(shù)建立了福利受損模型，利用曠場行為分析和O迷宮實驗研究不同福利受損程度對大鼠行為學(xué)的影響，同時觀測不同福利損傷情況下大鼠肝臟組織內(nèi)NF-κB的表達水平，比較二者之間的關(guān)系。

本研究采用了管狀容器制動術(shù)作為SD大鼠福利受損模型的制作方法，行為學(xué)評估使用了曠場行為分析和O迷宮實驗。動物制動術(shù)目前廣泛應(yīng)用于身心壓力引發(fā)各類動物損害的實驗研究，它可以模擬動物實驗中的抓取、保定等因素對實驗動物造成的身心損害，是一種較為常用的輕度福利損害手段，能造成福利水平的下降[2]。曠場行為分析主要反映了動物對新環(huán)境的探索、習(xí)慣及伴隨的情緒變化，通過觀察其在新環(huán)境中的自主行為、探索行為和緊張度等，可反映動物的心理狀態(tài)[9-10]。目前一些文獻研究表明，當(dāng)動物因應(yīng)激而產(chǎn)生緊張、恐懼情緒時，會發(fā)生走格減少以及僵立、蜷臥等現(xiàn)象。從本次曠場實驗可以發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)束縛后，嗅聞、直立等自主活動明顯減少，停留于中央格的時間顯著減少，表明大鼠的探索行為減少，自主活動受抑制，興奮性降低。O迷宮實驗根據(jù)動物對新異環(huán)境的探究特性和高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮情況，常用于焦慮和恐懼的情緒評價[11]。本次O迷宮實驗中，束縛后大鼠長時間停留于閉臂中，進入開放臂的次數(shù)及停留時間顯著下降，表明大鼠緊張和焦慮程度增加，對開放性場所持恐懼態(tài)度，因而長時間躲藏于閉臂中。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore在B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)的一類能和免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子特異結(jié)合的核因子，廣泛存在于各種真核細胞中，其活化時在機體內(nèi)環(huán)境多個自我調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用[12]。多種因素均可引起NF-κB水平上調(diào)，如細菌、病毒、紫外線、TNF-α、放射性物質(zhì)等，其中應(yīng)激也是引起其水平上調(diào)的重要因素[13]。本次實驗結(jié)果表明，在束縛應(yīng)激刺激造成的福利損傷過程中，SD大鼠肝臟NF-κB的表達水平不斷增高，大鼠活動興趣和活動能力呈明顯降低趨勢。這與以往文獻的報道相類似。

結(jié)果還顯示，束縛應(yīng)激干預(yù)第3天，即當(dāng)出現(xiàn)福利輕度受損時大鼠即出現(xiàn)體內(nèi)NF-κB表達水平增高，但此時行為學(xué)指標(biāo)的變化尚無統(tǒng)計學(xué)意義；隨著刺激天數(shù)的增加，在束縛時間達到10天時，NF-κB表達增高的趨勢進一步加劇，同時大鼠出現(xiàn)了明顯的行為異常。該結(jié)果提示，在福利受損的早期或輕度福利受損狀態(tài)下，實驗動物首先出現(xiàn)的是機體NF-κB表達的改變。當(dāng)福利受損持續(xù)到一定時間或加重至一定程度，即出現(xiàn)自主行為受抑制以及焦慮程度上升等一系列行為學(xué)改變。

綜上所述，研究結(jié)果表明，在福利受損的早期或輕度福利受損狀態(tài)下，實驗動物首先出現(xiàn)的是機體NF-κB表達的改變，然后才是機體行為學(xué)及其它功能的改變。而NF-κB 的改變能否作為動物福利受損的早期或預(yù)警指標(biāo)，或者嘗試在后期的實驗中加以干預(yù)阻斷福利受損路徑而使動物福利得以改善，從而使動物健康或?qū)嶒灲Y(jié)果不受影響尚待探討。