朱祥宇 陳 燁 王學(xué)文 田 楓 陳章健 周淑佩

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，北京 100044)(2. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，北京 100191) (3.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100191)

隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)的發(fā)展，新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種品系和動(dòng)物模型的創(chuàng)建以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系的研究成為當(dāng)下的重點(diǎn)任務(wù)之一。其具體內(nèi)容包括了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種的培育和標(biāo)準(zhǔn)化，即應(yīng)用前沿生物技術(shù)和動(dòng)物培育技術(shù)，開展資源動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的資源保存、遺傳育種和標(biāo)準(zhǔn)化等關(guān)鍵技術(shù)的研究。研發(fā)一批具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和我國優(yōu)勢(shì)動(dòng)物資源的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新品種品系，已經(jīng)成為現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)的一個(gè)主要研究方向。本文對(duì)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部自主培育的固醇輔酶A去飽和酶1基因突變SCD1-/-小鼠及其雜合子SCD1+/-小鼠組織學(xué)和血液生理生化特性進(jìn)行詳實(shí)的研究，以便為該鼠的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考資料[1]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SCD1-/-小鼠及其雜合子SCD1+/-小鼠，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部的屏障環(huán)境中，設(shè)施內(nèi)相對(duì)濕度為40%～70%，溫度控制在22～26 ℃，氨濃度小于14 mg/m3，噪聲小于60 dB，工作照度為150～300LX，動(dòng)物照度為15～20LX，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0010。

在實(shí)驗(yàn)過程中飼喂的小鼠飼料為SPF大小鼠生長繁殖飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0010。

1.2 儀器及設(shè)備

MEK-6138K血液分析儀(日本光電工業(yè)株式會(huì)社)；日立7170 A全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；3K18高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；分析天平(德國Sartorius公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1臟器質(zhì)量的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)前禁食 12 h，取8周齡的SCD1-/-及其雜合子SCD1+/-小鼠各40只雌雄各半，體質(zhì)量差異±5%，將其稱重后脫臼處死，迅速解剖取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢或睪丸，剔除臟器表面的筋膜和脂肪。用蒸餾水洗凈，用濾紙吸干組織表面的水份，稱取臟器樣品質(zhì)量。臟器系數(shù)以臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%表示。

1.3.2血生理指標(biāo)測(cè)定：應(yīng)用SCD1-/-及其雜合子SCD1+/-小鼠各60只，每種類型小鼠分2個(gè)年齡段，6～8周齡30只，雌雄各半；16～18周齡30只，雌雄各半，各組體質(zhì)量差異±10%。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，小鼠眼眶內(nèi)眥采血，微量取血管取血20 μL，用2 mL稀釋液稀釋，測(cè)定樣品中白細(xì)胞總數(shù)(WBC)，紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)，血紅蛋白濃度(HGB)，血細(xì)胞比容(HCT)，平均血細(xì)胞壓積(MCV)，平均血紅蛋白(MCH)，平均血紅蛋白濃度(MCHC)，紅細(xì)胞分部幅度(RDW)，血小板數(shù)(PLT)，血小板壓積(PCT)，平均血小板體積(MPV)血小板分布幅度(PDW)等。

1.3.3血生化指標(biāo)測(cè)定：小鼠眼眶內(nèi)眥采血，室溫下靜置1～2 h，10 000 r/min，離心5 min，分離血清，測(cè)定樣品中白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、肌酸激酶(CK)、總膽固醇(TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿酸(UA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)等生化指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均用軟件IBM SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P<0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 SCD1缺失對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

8周齡雌性SCD1-/-及其雜合子SCD1+/-小鼠臟器系數(shù)相比：心臟系數(shù)極顯著降低(P<0.01)，肝臟系數(shù)顯著升高(P<0.05)，卵巢極顯著降低(P<0.01)。雄鼠臟器系數(shù)相比，肝臟和脾臟極顯著升高(P<0.01)，心臟和肺臟顯著升高(P<0.05),睪丸極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 SCD1-/-及雜合對(duì)照組臟器系數(shù)的比較Table 1 Comparison of the organ coefficient between SCD1-/-mice and

注：8周齡SCD1/(-/-)小鼠與雜合子SCD1/(+/-)小鼠比較，*P<0.05，差異顯著；**P<0.01差異極顯著

Note：Compared with heterozygous SCD1+/-mice,*P<0.05,**P<0.01

2.2 SCD1基因缺失對(duì)小鼠血液細(xì)胞學(xué)和血清生化指標(biāo)的影響

2.2.1血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)的比較:6～8周齡SCD1-/-雌鼠RBC、MPV、PCT極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，MCV、MCH、RDW、PDW、PLT、LYM(%)都極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)。雄鼠RBC、MPV極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，PCT顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.05)，WBC、MCV、MCH、RDW、PLT、PDW、LYM、GRN都極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)。16～18周齡SCD1-/-雌鼠MCHC、PLT、PCT極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，HGB、GRN顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.05)，RDW、HCT、MCV極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)，WBC、MPV、LYM顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.05)。雄鼠RBC、MCHC、PLT、PCT極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，HCT、MCV、MCH、RDW極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)。見表2，表3。

2.2.2血生化指標(biāo)的比較:6～8周齡的SCD1-/-雌鼠ALB、TC、TG、AST極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，TP、ALP、ALT、UA、CK極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)。雄鼠ALB、TC、TG極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，ALP、ALT、UA、AST極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)。16～18周齡的SCD1-/-雌鼠ALP、UREA、TC極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，ALT、UA顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.05)。雄鼠ALB、TP、ALP、TC極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，UA顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.05)，ALT極顯著高于雜合對(duì)照組(P<0.01)。見表4，表5。

表2 SCD1-/-及雜合對(duì)照組的血液細(xì)胞學(xué)指標(biāo)Table 2 Values of hematological parameters of the SCD1-/-mice and

注：6～8周齡SCD1/(-/-)小鼠與雜合子SCD1/(+/-)小鼠比較，*P<0.05，差異顯著；**P<0.01差異極顯著

Note：Compared with heterozygous SCD1+/-mice,*P<0.05,**P<0.01

表3 SCD1-/-及雜合對(duì)照組的血液學(xué)指標(biāo)Table 3 Values of hematological parameters of the SCD1-/-mice and

注：16～18周齡SCD1/(-/-)小鼠與雜合子SCD1/(+/-)小鼠比較，*P<0.05，差異顯著;**P<0.01差異極顯著

Note：Compared with heterozygous SCD1+/-mice,*P<0.05,**P<0.01

表4 SCD1-/-及雜合對(duì)照組的血生化指標(biāo)的比較Table 4 Comparison of blood biochemical indexes between SCD1-/-mice and

注：6～8周齡SCD1/(-/-)小鼠與雜合子SCD1/(+/-)小鼠比較，*P<0.05，差異顯著；**P<0.01差異極顯著

Note：Compared with heterozygous SCD1+/-mice,*P<0.05,**P<0.01

表5 SCD1-/-及雜合對(duì)照組的血生化指標(biāo)的比較Table 5 Comparison of blood biochemical indexes between SCD1-/-mice and

注：16～18周齡SCD1/(-/-)小鼠與雜合子SCD1/(+/-)小鼠比較，*P<0.05，差異顯著；**P<0.01差異極顯著

Note：Compared with heterozygous SCD1+/-mice,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

SCD1-/-小鼠為第19條染色體末梢中部自發(fā)的基因突變近交系無毛小鼠，其自身具有如下特點(diǎn)：相對(duì)于其它品系小鼠食管壁更薄，橫斷面相對(duì)較大，老齡鼠食管壁彈性差；體內(nèi)含有瘦素，抗肥胖，而且機(jī)體代謝率和胰島素敏感性高，毛發(fā)稀疏，接近于無毛，免疫系統(tǒng)正常，能夠自行繁殖，10月齡存活率為100%。

根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)資料報(bào)道，引起無毛小鼠的成因越來越多樣化，品系也逐漸增多。例如在美國就有SKh：hr-1(白色)，SKh：hr-2(有色素沉著)，Crl：SKH1(hrhr)Br(有免疫能力)，HRS/J(T輔助細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能缺陷)等多個(gè)品系的基因突變無毛小鼠。而在中國也有豫醫(yī)無毛鼠[2]，BALB/c突變無毛鼠等多個(gè)有相關(guān)報(bào)道的無毛鼠品系。雖然都是自發(fā)性基因突變的無毛鼠，但突變的基因位點(diǎn)不同，使得突變小鼠具有不同的生物學(xué)特性。例如豫醫(yī)無毛鼠，與SCD1-/-小鼠相同都來自KM封閉群小鼠突變，但其自身特點(diǎn)卻與SCD1-/-小鼠有較大差異。雖都能自行繁殖，但豫醫(yī)無毛鼠母性差，不能很好的哺乳，壽命較短，常在6～10月齡不明原因死亡，突變位點(diǎn)在無毛基因第12外顯子突變。

動(dòng)物自身所具有的生物學(xué)特性是其區(qū)分其他動(dòng)物的基礎(chǔ)，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部自主培育的自發(fā)SCD1-/-基因突變小鼠尚未被廣泛應(yīng)用，對(duì)它的基本生物學(xué)特性缺乏系統(tǒng)的研究。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SCD1-/-小鼠血液學(xué)、血清學(xué)及臟器指標(biāo)的研究，為該鼠能夠得到進(jìn)一步應(yīng)用提供了有利的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

使用小鼠開展實(shí)驗(yàn)，常常選用6～8周齡性成熟的小鼠進(jìn)行。血細(xì)胞形成主要依靠骨髓的造血干細(xì)胞，小鼠12～14周齡期間，骨形態(tài)、骨礦物質(zhì)和骨生物力學(xué)性能才趨于穩(wěn)定[3]，故選擇6～8周齡及16周齡左右的小鼠測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臟器系數(shù)是其主要生物學(xué)特性資料[4]，能反映出動(dòng)物所處的生長發(fā)育階段和生理狀況[5-6]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)中＂活的試劑、活的精密儀器＂，血液學(xué)指標(biāo)是鑒定其遺傳品質(zhì)的重要依據(jù)[7-8]，血液生化指標(biāo)是動(dòng)物機(jī)體代謝過程的內(nèi)在反映，可作為檢測(cè)機(jī)體健康、生產(chǎn)性能以及適應(yīng)性的重要參考依據(jù)[9]。SCD1-/-及其雜合子SCD1+/-小鼠只有一個(gè)基因型不同，卻在臟器重量和血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果上表現(xiàn)出了較多的差異。8周齡SCD1-/-與雜合子SCD1+/-相比，體質(zhì)量差異不明顯，臟器系數(shù)相比心臟極顯著降低(P<0.01)，肝臟顯著升高(P<0.05)。有研究表明SCD1基因催化生成的MUFA具有多種生理功能，它是膜磷脂、甘油三酯、膽固醇酯、蠟脂等生物合成優(yōu)先利用的底物，缺乏時(shí)會(huì)引起脂質(zhì)脂化障礙，另外MUFA還可作為信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)輔助一些神經(jīng)元細(xì)胞完成分化，通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)實(shí)物攝取等。6～8周齡的SCD1-/-雌鼠生化指標(biāo)中TC、TG極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，雄鼠生化指標(biāo)中TC、TG極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01);16～18周齡的SCD1-/-雌鼠生化指標(biāo)中TC極顯著低于雜合對(duì)照組(P<0.01)，TG差異性不大。雄鼠生化指標(biāo)中TC極顯著低于雜合對(duì)照組(p<0.01)，TG差異性不大。該結(jié)果提示SCD1基因突變確實(shí)引起小鼠血脂水平、總膽固醇和甘油三酯的降低，隨著年齡的增長TG差異不明顯。

綜上所述，SCD1基因缺失對(duì)小鼠的臟器系數(shù)、血液細(xì)胞學(xué)和血清生化等指標(biāo)均會(huì)產(chǎn)生影響，本文為該小鼠生物學(xué)特性資料進(jìn)行了總結(jié)完善。