高麗霞，王高峰，劉志紅

（1.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院乳品與農(nóng)牧技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014035；2.內(nèi)蒙古涼城縣家畜改良工作站，內(nèi)蒙古 涼城013750；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，也是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。功能基因組學(xué)是生命科學(xué)的研究對象，包括結(jié)構(gòu)基因組的研究和蛋白質(zhì)組的研究等。復(fù)雜的翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)之間的相互作用等，這些現(xiàn)象幾乎無法從mRNA水平進(jìn)行判斷和解釋。從蛋白組進(jìn)行研究，將更清楚地闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制［1］。對皮膚毛囊的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在人和小鼠上，特別是人類表皮不同基因的表達(dá)和調(diào)控研究上。

1 人類皮膚毛囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究

雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)與質(zhì)譜鑒定相結(jié)合，作為一個(gè)強(qiáng)大的工具在分析蛋白質(zhì)的表達(dá)模式上應(yīng)用，應(yīng)用這一工具進(jìn)行皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究，識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)而用于皮膚相關(guān)疾病的治療。皮膚是身體最大的器官，由細(xì)胞和組織組成，能夠自行生長、分化、再生。皮膚保護(hù)體內(nèi)器官和系統(tǒng)免受外界環(huán)境的侵襲。皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以了解皮膚蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾以及皮膚疾病發(fā)病機(jī)理等，進(jìn)而解決目前棘手的皮膚疾病問題。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫研究的目的是通過角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的定量定性信息收集，將基因表達(dá)的異常模式提供給研究人員，最終找出信號(hào)通路和不同皮膚疾病的發(fā)病機(jī)理。到1995年時(shí)，2-DE數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)增加到3 154個(gè)，已鑒定出的多肽增加到1 082個(gè)，在研究過程中進(jìn)一步結(jié)合了如下程序：①已知人類蛋白的協(xié)同泳動(dòng)；②2-DE凝膠免疫組化；③考馬斯亮藍(lán)染色的微序列測序；④質(zhì)譜分析；⑤牛痘病毒的全稱cDNA表達(dá)以及全長cDNA的體外轉(zhuǎn)錄與翻譯［2］。在1993年，研究者將3 038個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)列在了人類皮膚蛋白質(zhì)雙向電泳數(shù)據(jù)庫中，大多數(shù)蛋白對應(yīng)有轉(zhuǎn)錄后的修飾，這些蛋白中已鑒定出來的蛋白多肽有763個(gè)，并附有SSP號(hào)、等電點(diǎn)、分子量、細(xì)胞定位和評價(jià)值。其中176個(gè)蛋白在數(shù)據(jù)庫中有微陣列記錄。

顏色和卷曲這些毛發(fā)的特征都是由基因決定的，Heywood等對發(fā)質(zhì)和頭發(fā)成分的差異是否受相關(guān)基因的控制展開調(diào)查。研究292個(gè)女性的頭發(fā)，結(jié)果顯示一串66 kDa的蛋白質(zhì)與高質(zhì)量的頭發(fā)相關(guān)。中低分子量（14～29 kDa）的蛋白出現(xiàn)在染色劑的使用者以及低質(zhì)量的頭發(fā)試驗(yàn)群體中。所有受試者的氨基酸分析結(jié)果表明，毛發(fā)中絲氨酸和蘇氨酸的水平有雙峰頻率分布，暗示其與遺傳因素有關(guān)。研究數(shù)據(jù)表明，絲氨酸和蘇氨酸的高水平表達(dá)量影響毛發(fā)的感官質(zhì)量。此外，半胱氨酸水平較低與頭發(fā)顏色、質(zhì)量有關(guān)，高質(zhì)量的頭發(fā)可能更耐受染色劑的傷害。對頭發(fā)的彈性模型研究中揭示出，高質(zhì)量（4.65 GPa）毛發(fā)彈性顯著高于所有中、低質(zhì)量的頭發(fā)（4.30 GPa）。由此得出結(jié)論，頭發(fā)的成分和抗拉性能與頭發(fā)的質(zhì)量有關(guān)。由此假設(shè)頭發(fā)質(zhì)量可能是由基因決定的，了解頭發(fā)的組成及其特性之間的關(guān)系，可以在未來針對每個(gè)人的頭發(fā)組成，設(shè)計(jì)生產(chǎn)不同的產(chǎn)品［3］。

2 小鼠皮膚毛囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究

皮膚毛囊中的大部分蛋白，主要是角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白，通過變性可以將其提取出來，但由于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的交聯(lián)調(diào)控，15%～20%的角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白難以得到。鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)在可以鑒別異構(gòu)肽蛋白質(zhì)組，甚至是翻譯后的修飾的蛋白質(zhì)組中300個(gè)以上的成分。來源于不同細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，表明交聯(lián)過程可以有效地利用可變資源產(chǎn)生有極大穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)。通過建立小鼠模型，研究異常毛發(fā)機(jī)理，了解蛋白組可以對蛋白缺失的毛干結(jié)構(gòu)的缺陷提供研究基礎(chǔ)。因此，通過毛發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)研究近交系小鼠，為人類毛囊發(fā)育提供研究基礎(chǔ)。提供一些離散的和無創(chuàng)傷的人類蛋白質(zhì)組樣本，通過對其皮膚附屬物蛋白組學(xué)研究進(jìn)而用于某些疾病的診斷治療［4］。

Huang等對小鼠皮膚進(jìn)行了比較蛋白組學(xué)研究，指出哺乳動(dòng)物的皮膚由于經(jīng)常暴露在不同的環(huán)境壓力下，從而對不同壓力、機(jī)體都會(huì)產(chǎn)生特異性的應(yīng)答，通過蛋白質(zhì)組分析可以評估機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。通過研究得到500多個(gè)蛋白點(diǎn)，建立了BALB/c小鼠皮膚的參考蛋白質(zhì)組圖譜，鑒定到了對應(yīng)于28個(gè)不同的皮膚蛋白質(zhì)的44個(gè)蛋白點(diǎn)。表皮中高表達(dá)的有25個(gè)蛋白質(zhì)，皮下組織中表達(dá)的有9個(gè)。研究得到了在有外界壓力的環(huán)境中特異性表達(dá)的功能多樣的蛋白，這些功能主要包括應(yīng)激反應(yīng)、生長抑制、細(xì)胞凋亡、結(jié)構(gòu)完整性的保持、翻譯后的調(diào)控、鈣結(jié)合、能量代謝、膽固醇運(yùn)輸和自由基的清除［5］。

Huang在小鼠皮膚蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了蛋白異構(gòu)酶、78 kDa的葡萄糖調(diào)控蛋白前體、熱激蛋白 60（heat shock protein 60，HSP60）、熱激蛋白70 （heat shock protein 70，HSP70）和熱激蛋白 27（heat shock protein 27，HSP27） 這 5個(gè)分子伴侶。蛋白異構(gòu)酶主要在皮下組織中表達(dá)，HSP27主要在表皮表達(dá)。HSP27、HSP60以及HSP70表達(dá)水平的變化反映了皮膚對熱或冷應(yīng)激，暗示皮膚對溫度壓力的反應(yīng)與這些分子伴侶有關(guān)。由此建立了大量的小鼠皮膚蛋白質(zhì)組圖譜參考標(biāo)記，奠定了未來對表皮和皮下組織的環(huán)境應(yīng)答機(jī)理的研究基礎(chǔ)［6］。

Robert等研究表明鳥槍法可以區(qū)分不同近交系的小鼠毛干軸。分析所提供的總毛干，發(fā)現(xiàn)在11個(gè)小鼠品系和5個(gè)突變體中，有100多個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)差異顯著。毛干缺陷與單基因突變相關(guān)。毛干提供了一個(gè)隨機(jī)的采樣物種的蛋白質(zhì)組，對整個(gè)表皮附屬物和整個(gè)身體的重要功能研究，毛干是很好的模型［6］。

3 羊皮膚毛囊蛋白質(zhì)組學(xué)研究

正皮質(zhì)、中間皮質(zhì)和副皮質(zhì)區(qū)是羊毛的3種不同皮質(zhì)層，其中有大量的細(xì)胞。研究表明，半胱氨酸濃度在副皮質(zhì)區(qū)高于正皮質(zhì)區(qū)。卵泡原位雜交研究表明，富含硫的蛋白最初在副皮質(zhì)纖維表達(dá)，之后逐漸均勻擴(kuò)散在整個(gè)纖維中表達(dá)，完成角質(zhì)化的過程。相反，甘氨酸和酪氨酸含量高的蛋白質(zhì)最初在正皮質(zhì)囊泡中表達(dá)。研究人員采用一系列方法分離皮質(zhì)層和副皮質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示在副皮質(zhì)細(xì)胞中半胱氨酸水平更高。電泳研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)層和副皮質(zhì)層細(xì)胞中有許多差異蛋白的表達(dá)，但不清楚具體是哪種蛋白質(zhì)，似乎是副皮質(zhì)區(qū)包含超高硫類蛋白質(zhì)的比例更高。

羊毛的角質(zhì)層賦予了羊毛纖維重要的特征，這些特征如手感和耐磨性均影響著羊毛纖維的內(nèi)在特性和紡織性能。由于羊毛角質(zhì)層中存在大量的二硫鍵和交聯(lián)多肽，導(dǎo)致科研人工分離純粹的羊毛角質(zhì)層以及提取蛋白質(zhì)的難度增加，清楚闡述羊毛角質(zhì)層蛋白質(zhì)組學(xué)非常困難。Michinari等利用2-DE技術(shù)，對韓國本地山羊羊絨進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了10種蛋白成分。質(zhì)譜鑒定其中的9種蛋白成分，有3種分子量在70～120 kDa，等電點(diǎn)為5.3，分別為角蛋白Ⅱ型纖維、角蛋白48 kⅠ型纖維復(fù)合物8c-1和細(xì)胞溶質(zhì)磷脂酶A2。另外3種蛋白成分分子量在42～50 kDa，表達(dá)量在冬季升高，分別是角蛋白Ⅰ型纖維47.6 kDa、角蛋白Ⅱ型纖維復(fù)合物7C和角蛋白Ⅱ型纖維復(fù)合物5。剩余的3種蛋白成分分子量低于17 kDa，分別是毛發(fā)角蛋白Ⅱ型中間纖維絲、角蛋白高硫基質(zhì)蛋白ⅢB2（等電點(diǎn)5.2和5.9各1種），這些蛋白與羊毛纖維的特性均有著重要的關(guān)系［7］。

Henning等采用化學(xué)和酶消化的方法對高純度的美利奴羊毛角質(zhì)層進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，鑒定了108個(gè)蛋白點(diǎn)，結(jié)果表明這些蛋白點(diǎn)大部分屬于角蛋白和非角蛋白家族，它們在分子組裝和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中起重要的作用。表皮主要由角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin associated proteins，KAPs）、中間纖維絲蛋白質(zhì)（intermediate filament proteins，IFPs）和細(xì)胞骨架角蛋白組成。非角蛋白結(jié)構(gòu)蛋白有組蛋白、微管蛋白和細(xì)胞橋粒。由此得出結(jié)論，不同蛋白組成了角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)和纖維，最重要的表皮層組成成分是角質(zhì)化的蛋白家族KAPs和IFPs。

4 展望

人類一直在努力使羊毛與其他纖維特別是人工合成物相比更具競爭力，因此需要深入了解羊毛的蛋白質(zhì)成分和羊毛性能之間的關(guān)系，進(jìn)而指導(dǎo)羊的育種。首先需要獲得羊毛蛋白質(zhì)組圖譜，通過凝膠和非凝膠技術(shù)及其他方法開發(fā)可靠的定量蛋白質(zhì)表達(dá)方法。然而，要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，面臨著很多的挑戰(zhàn)，如在羊毛蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用方面，包括公共訪問數(shù)據(jù)庫中羊毛蛋白質(zhì)序列信息的相對缺乏；羊毛纖維中眾多的蛋白質(zhì)中，Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白的高度同源性；角蛋白相關(guān)蛋白家族中高度的同源性和多態(tài)性；角蛋白超過其他羊毛蛋白的數(shù)量［8］。

參考文獻(xiàn)：

［1］張奉學(xué)，王新華.蛋白質(zhì)組學(xué)研究及其對中醫(yī)藥發(fā)展的啟示［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（6）：486-488.

［2］HUANG C M，F(xiàn)OSTER K W，DESILVA T，et al.Comparative proteomic profiling of murine skin ［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2003，121 （1）：51-64.

［3］HEYWOOD D M， VRETTOU C， WOOD J，et al.Investigating the relationship between the hair fiber proteome and hair quality［J］.International Journal of Cosmetic Science，2004，26（5）：268.

［4］PLOWMAN J E， DEB-CHOUDHURY S， CLERENS S，et al.Unravelling the proteome of wool:towards markers of wool quality traits ［J］.Journal of Proteomic，2012，75（14）：4315-4324.

［5］HUANG C M，ELMETS C A，VAN KAMPEN K R，et al.Prospective highlights of functional skin proteomics［J］.Mass Spectrom Rev，2005，24（5）：647-660.

［6］RICE R H.Proteomic analysis of hair shaft and nail plate［J］.J Cosmet Sci，2011，62（2）：229-236.

［7］YOKOHAMA M，MASUDA T，AMANO T，et al.Proteome analysis of cashmere ［J］.Animal Science Journal，2004，75（5）：401-405.

［8］RICE R H，BRADSHAW K M，DURBIN-JOHNSON B P，et al.Differentiating inbred mouse strains from each other and those with single gene mutations using hair proteomics［J］.PLoS One，2012，7（12）：e51956.