(海南省動物疫病預防控制中心,海南 海口 570100)

0 引言

1887年，意大利發(fā)現(xiàn)首例禽流感，OIE將其劃為A類傳染病，中國將此病劃為一類傳染病。禽流感病毒屬于正黏病毒科，直徑為80～120nm，呈絲狀體等形態(tài)。囊膜表面有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)兩種纖突。AIV最顯著的生物學特征之一是亞型眾多，至今已發(fā)現(xiàn)A型流感病毒的血凝素(HA)亞型有16種，神經(jīng)氨酸酶(NA)有10種亞型，通過基因重組形成具有新特征的病毒。各個亞型之間無交叉免疫性，給疫苗免疫造成很大困難，且禽流感一旦暴發(fā)往往給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的打擊，高致病性禽流感可以導致動物及人類死亡，因此，建立一種快速、高效的檢測方法是快速診斷方法是預防禽流感的重要途徑。

1 血清學檢測

1.1 血凝(HA)試驗和血凝抑制(HI)試驗

該試驗既是WHO進行全球流感監(jiān)測采用的普及方法,也是我國目前對禽流感感染和免疫的主要檢測手段。該方法操作簡單、特異性高，但是需要排出NDV等病毒的干擾，不能直接檢測出病料中的病毒，并且可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

該方法敏感性好,可以檢測抗體及抗原,適用于大批血清樣品的檢測。目前,ELISA檢測方法的研究在國內(nèi)外發(fā)展很快,主要集中在診斷介質(zhì)和診斷試劑的改進以及縮短診斷時間。有學者利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了H5N1亞型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、類病毒脂質(zhì)體和病毒樣顆粒,建立了相應的檢測方法。試驗表明,利用3種抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重復性和穩(wěn)定性,批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%,但單獨表達的HA蛋白和類病毒脂質(zhì)體特異性更好,而且類病毒脂質(zhì)體有更高的免疫反應性,與滅活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亞型AIV抗體水平檢測方面更具有應用前景。

1.3 電化學發(fā)光免疫方法

亓文寶[1]等用釕聯(lián)吡啶標記H9亞型AIV的單克隆抗體,用生物素標記H9亞型AIV的多克隆抗體,優(yōu)化生物素化多抗和釕標單抗最佳工作濃度,確定臨界值和反應譜,對所建立的方法進行敏感性、特異性和重復性試驗。結(jié)果表明所建立的H9亞型AIV型特異性電化學發(fā)光免疫檢測方法可以用于臨床樣品檢測,對H9亞型禽流感的監(jiān)測和防控具有重要意義。

1.4 納米熒光檢測方法

為了實現(xiàn)對禽流感病毒的簡便、快速檢測，有學者采用納米熒光標記方法對H9亞型AIV進行研究建立相應檢測體系，研發(fā)適合H9亞型AIV早期感染現(xiàn)場診斷的納米熒光檢測試劑盒。結(jié)果表明:建立的H9亞型AIV納米熒光檢測卡特異性良好，與其他亞型AIV及禽類呼吸道疾病病原無交叉性，靈敏度可達到0.031HA單位，本試驗建立的H9亞型AIV納米熒光檢測卡特異和敏感，檢測結(jié)果準確，可用于H9亞型禽流感的檢測。

1.5 膠體金免疫層析法

劉曉燕[2]對HI效價最高單克隆抗體進行純化,制備了金標抗體玻璃纖維素膜；同時制備了兔抗H7亞型AIV血清并進行純化,包被再硝酸纖維素膜上,最終制備了膠體金免疫層析試紙條。該試紙條特異性、敏感性及重復性均符合要求,可作為H7亞型禽流感快速診斷的檢測試劑。

2 分子生物學診斷方法

2.1 多重PCR

張曼[3]等根據(jù)GenBank已登錄的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的基因序列合成3對引物，通過優(yōu)化反應條件,建立了同時鑒別3種病毒的多重PCR方法,并對其特異性、敏感性和重復性進行檢驗。該方法能快速鑒別3種病毒,敏感性較強,結(jié)果顯明所建立的AIV、NDV和FAV-4多重PCR檢測方法可以用于臨床上3種病原的鑒別診斷。

2.2 實時熒光定量PCR

該方法是在DNA擴增反應中，以熒光物質(zhì)測每次PCR循環(huán)產(chǎn)物總量的方法。王晨曦[4]等通過分析NCBI數(shù)據(jù)庫中H7亞型AIV的HA基因序列,設計特異性引物,建立了針對北美H7亞型的實時熒光定量PCR檢測方法。該方法靈敏度可達53 Copies/μL。為監(jiān)測北美H7亞型AIV提供了良好的技術(shù)支撐,可用于外來AIV的監(jiān)測。

2.3 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)

該技術(shù)具有操作簡單、不需要大型儀器設備、成本低廉、反應時間短、結(jié)果判定簡單等優(yōu)點,且具有比常規(guī)分子生物學方法更高的靈敏度和特異性。有研究針對H5亞型禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因8個保守區(qū)域設計了3對擴增引物,添加到RT-LAMP反應體系中,并加入優(yōu)選的凍干保護劑進行冷凍干燥。結(jié)果顯示該反應體系可以凍干處理等步驟研制成試劑盒,經(jīng)驗證該方法特異性好、敏感性高、并且操作簡捷,適宜在基層獸醫(yī)實驗室以及養(yǎng)殖場推廣應用。

3 結(jié)語

近些年來禽流感的檢測技術(shù)有了很大的發(fā)展，但每種檢測方法都各具優(yōu)缺點，固定一種檢測手段很難滿足不同情況的檢測，比如在養(yǎng)殖場或疫情爆發(fā)地可以用膠體金診斷試紙條進行初篩，這種方法不需要大型儀器、操作簡單，且結(jié)果判定迅速，而進行確診的時候就要借助大型儀器(如熒光PCR儀)進行復診，如有需要可繼續(xù)按照病毒分離的方法進行確診。因此，實際工作中應當根據(jù)實際情況比較各種檢測方法的優(yōu)劣，選擇合適的檢測方法。另外，應推動成熟的研發(fā)成果商品化，使檢測工作結(jié)果更加準確快速便捷，促進我國動物醫(yī)學及畜牧業(yè)健康快速持續(xù)發(fā)展。