王琪然

【摘 要】 本研究采用沙門氏菌多克隆抗體特異性標記沙門氏菌，并輔以膜選擇通透性熒光染料碘化丙啶（PI）來標記區(qū)分死菌和活菌，采用流式細胞儀進行定量檢測分析。實驗結(jié)果表明：流式細胞儀法方法的靈敏度為1.83 × 103 CFU/mL，與平板培養(yǎng)計數(shù)法相比，兩種方法的檢測結(jié)果具有很高的一致性，檢測時間由原先的3 d～5 d縮短至35 min。綜上所述，流式細胞儀法能快速、定量地檢測出牛奶樣品中的沙門氏菌，在食源性致病菌的快速篩查和監(jiān)控中具有重要的應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】 流式細胞儀；沙門氏菌活菌；快速檢測；牛奶

【中圖分類號】R197.3 【文獻標志碼】B 【文章編號】1005-0019（2018）24-245-01

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型（ATCC13311）、腸沙門氏菌腸亞種嬰兒血清型（CICC21482）、大腸桿菌（ATCC10798）、霍亂弧菌（CICC23794）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、副溶血弧菌（ATCC17802）、單增李斯特氏菌（ATCC19111）均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

牛奶中微生物快速純化試劑盒購于北京亦泰生物技術(shù)有限公司，偶聯(lián)有異硫氰酸熒光素（FITC）的沙門氏菌多克隆抗體購于美國Kirkegaard Perry Laboratories公司，核酸熒光染料碘化丙啶（PI）購于美國Thermo Fisher Scientific公司。全脂滅菌乳購于北京三元食品股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A50-Micro型流式細胞儀 英國Apogee公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；1-14型離心機 美國Spectronics公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌懸濁液的制備

將本文1.1中所述的7種菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)12 h。取菌液，12000 × g離心10 min，棄去上清液，底部沉淀用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸。用滅菌的PBS將重懸后的腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型（沙門氏菌ATCC 13311）純菌液進行10倍系列稀釋。

1.3.2 沙門氏菌的染色

將沙門氏菌ATCC 13311采用綠色熒光染料FITC標記的抗體進行特異性標記，再采用紅色熒光材料PI標記區(qū)分死菌與活菌，通過流式細胞儀的熒光通道進行檢測。。

1.3.3 流式檢測方法的特異性

將本研究1.1中的7種菌株制備成107 CFU/mL菌懸液，再將菌懸液分別與FITC標記的沙門氏菌多克隆抗體在37℃下孵育15 min，用流式細胞儀驗證其特異性。

1.3.4 流式檢測方法的線性與靈敏度

將沙門氏菌ATCC 13311用PBS溶液進行10倍系列稀釋，再分別采用國標中菌落總數(shù)測定的平板培養(yǎng)計數(shù)法和流式檢測法進行定量檢測，驗證流式檢測法的線性與靈敏度。

1.3.5 人工污染滅菌乳樣品的檢測

將沙門氏菌ATCC 13311接種到煮沸處理過的滅菌乳中，制備成人工污染的乳樣品，濃度為2.00 × 103～2.00 × 108 CFU/mL。按照牛奶中微生物快速純化試劑盒純化沙門氏菌說明書操作，去除滅菌乳中的蛋白顆粒和脂肪，得到純化的樣品溶液，經(jīng)雙染色后，用流式細胞儀進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 流式檢測方法的線性與靈敏度

采用流式細胞儀法和平板培養(yǎng)計數(shù)法同時對10倍系列稀釋的沙門氏菌進行檢測。將菌液濃度在103～108 CFU/mL的檢測結(jié)果繪制出標準曲線，如圖1所示，流式檢測法與平板計數(shù)法線性良好（R2=0.9988），檢測范圍為2.27 × 103～3.49 × 108 CFU/mL，靈敏度為2.27 × 103 CFU/mL 。

2.2 流式細胞儀檢測方法的特異性

將本研究1.1中的7種菌株分別與沙門氏菌多克隆抗體在進行反應(yīng)，只有沙門氏菌能檢測到綠色熒光。結(jié)果表明沙門氏菌多克隆抗體與除沙門氏菌外的菌株不發(fā)生反應(yīng)，表明建立的流式細胞儀檢測方法特異性良好。

2.3 流式細胞儀法檢測死活菌的驗證 沙門氏菌與偶聯(lián)有FITC的多克隆抗體反應(yīng)后，發(fā)出綠色熒光；而當沙門氏菌死菌和活菌與碘化丙啶反應(yīng)后，只有死菌發(fā)出紅色熒光。因此，通過流式細胞儀檢測后，沙門氏菌活菌只會檢測到綠色熒光，死菌會檢測到紅色和綠色兩種熒光（如圖2所示），說明流式細胞儀法可以有效區(qū)分沙門氏菌死活菌。

2.4 人工污染牛奶樣品的檢測 人工污染牛奶樣品的檢測結(jié)果顯示（表1），當沙門氏菌的濃度在103 ～108 CFU/mL時，流式細胞儀法檢測沙門氏菌的檢測結(jié)果與添加濃度非常接近，說明流式檢測方法準確性良好。而當沙門氏菌的濃度大于108 CFU/mL或者小于103 CFU/mL時，超出儀器檢測限。因此，人工污染牛奶樣品中流式檢測方法的檢測范圍為1.83 × 103～1.99 × 108 CFU/mL，靈敏度為1.83 × 103 CFU/mL。

3 討論

本研究所建立的流式細胞儀方法檢測牛奶中沙門氏菌靈敏度為1.83 × 103 CFU/mL、特異性良好，檢測時間僅需35 min，與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法、免疫膠體金試紙條法、電阻抗法以及熒光PCR方法相比較，檢測時間明顯地縮短。綜上所述，本研究所建立的流式細胞儀檢測方法不僅適用于液態(tài)牛奶的檢測，同時也適用于奶粉樣品的檢測。因此本研究建立的方法可以快速、靈敏、高效地篩查奶粉是否被沙門氏菌污染。

參考文獻

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