(南召縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所, 河南 南召 474650)

1 疊氮溴化丙錠的介紹

疊氮溴化丙錠（PMA）是一種光敏反應(yīng)染料，它對DNA具有非常高的親和力。當(dāng)細(xì)胞膜處于不完整狀態(tài)或者細(xì)胞已經(jīng)死亡，細(xì)胞膜對外界的物質(zhì)的進(jìn)出就沒有了選擇性，PMA就可以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA進(jìn)行結(jié)合，在光照作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)后的DNA就不能作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，殘留在溶液中的未被結(jié)合的PMA在光照下與水分子形成羥胺化合物，從而阻止其與在提取過程中活菌產(chǎn)生的DNA結(jié)合，影響檢測結(jié)果。而對于活的細(xì)胞而言，細(xì)胞膜具有選擇性，PMA便不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。將PMA這種特性與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)，便可以實現(xiàn)對活菌的檢測[1]。

2 影響活菌檢測的因素

2.1 采集的樣品

PMA偶聯(lián)熒光PCR技術(shù)對樣品的要求比較高。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的樣品，食品樣品和臨床上的病料中常常含有一些無機物質(zhì)，有機物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在既可以降低PMA的有效濃度，也可以干擾PMA與核酸的交聯(lián)反應(yīng)。詳細(xì)的說，樣品中的無機物和有機物會造成樣品的濁度提高，樣品越渾濁，光的透過性就越差，越影響PMA與樣品在光照條件下的交聯(lián)反應(yīng)。為了避免和減少因樣品采集帶來的誤差，Luo等人在一項研究中提出，要嚴(yán)格規(guī)范濁度的閾值，這樣對每一份樣品檢測具有更重要的意義和參考價值。有研究表明，當(dāng)樣品的濁度達(dá)到10個散射濁度單位的時候，樣品的濁度對于PMA交聯(lián)DNA是沒有影響的。當(dāng)樣品的濁度高于10個散射濁度時，樣品的濁度對于PMA交聯(lián)DNA具有非常大的影響。

2.2 PMA與DNA作用階段

PMA與DNA作用階段主要是指PMA進(jìn)入細(xì)胞膜受損傷的過程和PMA結(jié)合DNA的過程。PMA是一種對光較為敏感的染料，即便在普通光源下，也能降低PMA的有效濃度。因此，在PMA與細(xì)胞核DNA作用的過程中要避光。在這個過程中，PMA的濃度、PMA與核酸的作用時間，溫度等都會影響最終的檢測結(jié)果。有些學(xué)者在參考別的研究者活菌檢測技術(shù)時，設(shè)置了同樣的溫度、濃度和時間，但是結(jié)果卻不甚理想。其主要原因是樣品不同，最佳的PMA的濃度和作用時間也會有很大的差異。如較低濃度時，PMA是不能夠完全結(jié)合掉所有的死菌DNA，那么部分沒有結(jié)合的死菌的DNA便可以作為模板被擴(kuò)增出來，從而造成活菌檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。如果PMA的濃度過高，PMA也可以滲入到活的細(xì)胞中，將部分活的細(xì)胞DNA結(jié)合掉，造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，無論是做哪一項活菌檢測，PMA的濃度和作用時間等參數(shù)要先優(yōu)化，后使用。PMA進(jìn)入細(xì)胞的效率和有效結(jié)合DNA的效率還與溫度有關(guān)。有研究表明。在室溫的條件下，PMA結(jié)合DNA的效率最高。另外，PMA與細(xì)胞的作用時間也要考慮到位。作用時間過長，PMA也能夠滲透到活細(xì)胞中，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確[2]。

2.3 PMA與DNA的交聯(lián)

在光照條件下，PMA與DNA能夠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。但是有效的交聯(lián)反應(yīng)仍然依賴于光源和光處理時間的長短。光源的光譜不同時，PMA的激活效果也存在很大的差異。最為合適的光源是光的波長能夠有效激發(fā)PMA分解。研究表明，500～750w的金屬鹵素?zé)羰亲罴训墓庠?。光照時，樣品要放在光下20～30cm處，保障PMA與樣品中的DNA有效交聯(lián)。但是值得注意的是，在較高功率的鹵素?zé)粽丈湎?，部分活菌會?yán)重受熱死亡。為了避免這種現(xiàn)象的發(fā)生，Vesper等人首次將發(fā)光二極管代替鹵素?zé)簦@樣既保障了激發(fā)PMA的最佳發(fā)射波長，又避免了熱量造成的活菌的死亡。光照時間是整個處理中不可小覷的環(huán)節(jié)。樣品，實驗條件的不同，光照時間也會有很大的差異。一般情況下，光照時間控制在20min以內(nèi)。光照時間過短，PMA與DNA的交聯(lián)反應(yīng)不徹底，同時，殘留在液體中的游離的PMA也不能完全失活。較長時間的光照時間又會引起活菌的死亡。因此，需要選擇恰當(dāng)?shù)墓庹諘r間。

3 目標(biāo)基因的選擇

除了以上信息需要考慮外，目標(biāo)基因的位置和片段的大小也會影響最后的檢測結(jié)果。Soejima在用PMA偶聯(lián)PCR技術(shù)檢測單增李斯特菌的過程中發(fā)現(xiàn)，片段越長，PMA對熒光PCR的抑制效果越明顯。還有學(xué)者認(rèn)為，對于同一種細(xì)菌檢測時，運用不同的片段，檢測得到的結(jié)果差異非常顯著[3]。

4 PMA偶聯(lián)熒光PCR的應(yīng)用

Zhu等人用PMA-qPCR檢測樣品中的副溶血性弧菌的活菌量時發(fā)現(xiàn)，PMA的最佳濃度時8ug/mL，并且當(dāng)細(xì)菌的濁度低于10個NTU時，OD值低于0.8時，PMA能夠有效抑制死菌的擴(kuò)增。黃韻等人運用PMA-qPCR檢測技術(shù)成功檢測出處于VBNC狀態(tài)下的單增李斯特菌活菌。Li等人在用PMA-qPCR檢測沙門氏菌活菌檢測，并對基因片段的長度進(jìn)行優(yōu)化和選擇，結(jié)果表明，PMA對死菌DNA的抑制作用與核酸片段長度有關(guān)，核酸片段長度越長，PMA對死菌的抑制作用越好。當(dāng)長度高于260bp時，檢測的靈敏性會突然下降。長度低于130bp時，則無法有效抑制死菌DNA的擴(kuò)增。

[1]陳麗芬.兩種實驗方法檢測食品中金黃色葡萄球菌的比較和分析[J].醫(yī)學(xué)動物防制,2016(05)：581-582+58.

[2]吳碧文.金黃色葡萄球菌在不同食品中的檢出率分析[J].福建分析測試,2015(02)：51-54.

[3]張崇娥.不同食品中金黃色葡萄球菌的檢出分析[J].求醫(yī)問藥(下半月),2012(07)：9-10.