(南召縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所, 河南 南召 474650)

1 HRM的發(fā)展史

HRM技術(shù)是近幾年來(lái)新興起的一種用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的診斷技術(shù)。HRM檢測(cè)技術(shù)除了具有高通量、低成本、靈敏性和特異性高之外，真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，因此，HRM檢測(cè)技術(shù)深受國(guó)內(nèi)外科研人員的關(guān)注并得到廣泛的應(yīng)用。已經(jīng)商品化的用于HRM檢測(cè)的儀器是LightScanner，它是由美國(guó)Idaho公司生產(chǎn)的專門用于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)的儀器，可以在5min的時(shí)間里檢測(cè)96或者384個(gè)樣品進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)。此外，市場(chǎng)上其他公司的熒光定量PCR儀器也可以完成對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，如伯樂(lè)公司和羅氏公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀可以完成對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的突變位點(diǎn)的檢測(cè)和基因分型。目前,常用的應(yīng)用于基因分型的比較準(zhǔn)確的方法之一是探針?lè)?，但是探針的合成成本比較高，因此，其臨床應(yīng)用也受到極大的限制。而本文所介紹的HRM技術(shù)不會(huì)受到堿基的位點(diǎn)或者堿基的類型限制，也不需要合成價(jià)格較高的探針，只需要在反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行一步溶解，再用儀器對(duì)溶解曲線進(jìn)行分析，完成基因分型和突變位點(diǎn)的掃描[1]。

2 高分辨率溶解曲線技術(shù)的原理

高分辨率溶解曲線技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，就是在PCR擴(kuò)增結(jié)束后，另設(shè)置一個(gè)解鏈的步驟。在溫度逐漸上升的階段，DNA雙鏈由于受到熱力作用，堿基之間的氫鍵會(huì)逐步打開(kāi)，在堿基雙鏈解開(kāi)到一半的時(shí)候，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)解鏈加劇的點(diǎn)，這個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的溫度就是DNA雙鏈的Tm溫度，在DNA雙鏈逐漸打開(kāi)的過(guò)程叫做溶解。在通常情況下，多用于有效區(qū)分GC含量差異較大或者片段長(zhǎng)度差異較大的核酸片段時(shí)，將溶解曲線溫度調(diào)整到每秒上升1℃。如有堿基差異較小的情況，那么升溫溫度一般設(shè)置在每秒上升0.1～0.3℃。因此，在溫度設(shè)置的過(guò)程中要考慮到堿基之間的差異的大小。HRM常用的染料主要為飽和燃料、熒光探針和單熒光標(biāo)記引物。其中飽和染料法較為常見(jiàn)，由于核酸片段堿基之間的組成不同，在溫度上升階段，DNA片段特異性熒光染料在釋放的過(guò)程中會(huì)有差異，根據(jù)差異獲得基因分型。雖然常用的是飽和燃料，但是不常用于HRM分型的SYBR Green染料仍然可以用于分型上，但是限制在2個(gè)片段或GC含量差異較大的基因分型上。熒光探針和單熒光標(biāo)記引物雖然也能分型，但是不常用[2]。

3 高分辨率溶解曲線技術(shù)的研究進(jìn)展

高分辨率溶解曲線技術(shù)可以在DNA溶解過(guò)程中產(chǎn)生不一樣的溶解曲線圖形從而有效區(qū)分核酸片段之間的差異，進(jìn)一步做突變檢測(cè)和基因分型。HRM基因突變檢測(cè)方法自被認(rèn)可以來(lái)，得到廣泛的應(yīng)用。

3.1 基因分型

基因分型是HRM檢測(cè)技術(shù)最為常用的一個(gè)功能。在這項(xiàng)功能中，筆者不用設(shè)計(jì)熒光探針就可以達(dá)到基因分型的目的。因?yàn)椴煌暮怂崞斡胁灰粯拥娜芙鉁囟?，不一樣的溶解溫度又有不一樣的溶解曲線。根據(jù)溶解曲線的吻合情況可以有效將野生型和突變型進(jìn)行有效區(qū)分。例如，有學(xué)者用HRM技術(shù)將人類的β球蛋白的HbS，HbC，HbE 3個(gè)基因型進(jìn)行有效區(qū)分。除了臨床上應(yīng)用較為廣泛之外，HRM在科研領(lǐng)域也有較多的應(yīng)用。例如，有學(xué)者用HRM技術(shù)區(qū)分16S rRNA，將細(xì)菌進(jìn)行分類；區(qū)分雞腺病毒血清型進(jìn)行分型等[3]。

3.2 甲基化研究和應(yīng)用

甲基化在機(jī)體正常的生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。核酸的甲基化是指核酸在甲基化轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)下，在基因組CpG島的CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位點(diǎn)共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基團(tuán)，甲基化是哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的調(diào)控方式之一。核酸的甲基化狀態(tài)改變后，基因的結(jié)構(gòu)和功能就會(huì)有很大的變化。溶解溫度之間的差異能夠反映出同原序列之間的差異。核酸片段經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽的處理，沒(méi)有甲基化的胞嘧啶成為尿嘧啶，尿嘧啶在擴(kuò)增過(guò)程中可以轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。這樣，甲基化和非甲基化就可以轉(zhuǎn)化成核酸片段之間的差異，進(jìn)而有效區(qū)分甲基化和非甲基化。高分辨率溶解曲線技術(shù)在甲基化的檢測(cè)中檢測(cè)靈敏度非常高，即便是0.1%的甲基化程度也能檢測(cè)出來(lái)。

3.3 突變掃描

HRM技術(shù)也常用于突變位點(diǎn)的篩查和發(fā)現(xiàn)新突變位點(diǎn)。早期Smitn研究發(fā)現(xiàn)，一名肺癌患者的表皮生長(zhǎng)因子發(fā)生突變，突變位點(diǎn)在第四號(hào)外顯子上。此后不久，另一科學(xué)家將HRM技術(shù)進(jìn)行可改進(jìn)，用于非小細(xì)胞肺癌患者的表皮生長(zhǎng)因子的掃描。之后，越來(lái)越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用HRM檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)側(cè)出突變位點(diǎn)與某些疾病的發(fā)生有很大的關(guān)系。例如:BRCA1和BRCA2的突變被證實(shí)與乳腺癌有關(guān)。另一位學(xué)者同樣用HRM技術(shù)對(duì)收集的結(jié)腸癌患者的樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)序結(jié)果的吻合度達(dá)到95%。

[1]楊彩虹,楊敏,于璐,等.高分辨率熔解曲線技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性的快速檢測(cè)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2017(05):403-412.

[2]王海英,劉志敏,鄭建禮,等.結(jié)核桿菌異煙肼表型耐藥與katG基因突變相關(guān)性研究[J].齊魯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2005(05):3.

[3]周長(zhǎng)凱,曹婧.結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼耐藥的分子機(jī)制[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2013(06)：731-732+73.