◎ 吳 冰，蔡先全，鄭傳發(fā)，邱 霞，蕭綺倩

（中山出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528403）

1999年，Kenneth Kinzler與Vogelstein B提出了“數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）”的概念[1]，該技術(shù)將DNA或RNA樣品分散成大量的微反應(yīng)單元，然后對眾多微反應(yīng)單元內(nèi)的靶序列進行單分子模板PCR擴增、熒光檢測和統(tǒng)計學(xué)分析，實現(xiàn)絕對定量。該技術(shù)不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品，直接檢測樣品中核酸的原始濃度，比傳統(tǒng)熒光定量PCR的靈敏度和精確性更高。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的基本原理

目前數(shù)字PCR主要分為3種：微孔式數(shù)字PCR、微滴式數(shù)字PCR和微腔式數(shù)字PCR。微孔式數(shù)字PCR是最早出現(xiàn)的數(shù)字PCR技術(shù)，在96或384孔聚丙烯板上完成；后來出現(xiàn)了微腔式數(shù)字PCR，采用了由多層軟刻蝕技術(shù)及聚二甲基硅材料制作成的系統(tǒng)；由于傳統(tǒng)的數(shù)字PCR技術(shù)取樣、操作復(fù)雜，成本較高；便衍生了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，微滴式數(shù)字PCR是目前相對成熟的數(shù)字PCR平臺，利用油包水乳化微滴顆粒作為反應(yīng)器進行檢測。目前，數(shù)字PCR儀主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTM dPCR系統(tǒng)。

目前，應(yīng)用最廣泛的是微滴數(shù)字PCR，該技術(shù)具有靈敏度高、成本低的特點，可實現(xiàn)DNA的絕對定量。其工作原理是把DNA分子稀釋到一定濃度，生成一定數(shù)目的微滴，然后進行PCR擴增，讀取陽性微滴數(shù)目。再根據(jù)泊松分布計算出樣本中的DNA分子數(shù)[2-3]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，與熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR對核酸含量較低的樣品檢測準(zhǔn)確率和靈敏度都較高[4-8]。

2 數(shù)字PCR的優(yōu)勢

數(shù)字PCR技術(shù)是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。它將熒光定量PCR反應(yīng)體系分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個微反應(yīng)器中包含或不包含1個或多個拷貝的目標(biāo)核酸分子（DNA模板），在反應(yīng)器中進行“單分子模板PCR擴增”。擴增結(jié)束后，檢測陽性反應(yīng)單元數(shù)目，利用統(tǒng)計學(xué)方法計算原始樣本中靶基因的拷貝數(shù)。

數(shù)字PCR不依賴對照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。此外，由于數(shù)字PCR在判讀結(jié)果時，僅判斷“有/無”兩種擴增狀態(tài)，因此熒光信號與設(shè)定閾值線的交點對其無影響，不依賴于Ct值。所以，數(shù)字PCR的讀數(shù)結(jié)果受擴增效率的影響很低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高，數(shù)字PCR實驗中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大地降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度。因此，數(shù)字PCR技術(shù)特別適合檢測復(fù)雜背景中的稀有突變。

由于數(shù)字PCR具有靈敏度高、特異性好和精確性高的優(yōu)點，它在極微量核酸樣本檢測、復(fù)雜背景下稀有突變檢測、表達(dá)量微小差異鑒定和拷貝數(shù)變異檢測等方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認(rèn)可，在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、單細(xì)胞基因表達(dá)和NGS測序文庫精確定量與結(jié)果驗證等諸多方面具有廣闊研究前景。Kalorama Information發(fā)布的研究報告顯示，到2019年全球數(shù)字PCR市場預(yù)計將達(dá)39.7億美元，中國是最主要的新興市場[9]。

3 數(shù)字PCR在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

核酸擴增技術(shù)是病原微生物檢測的一個重要方法，目前實驗室主要采用基于Taq Man探針法的熒光定量PCR體系對病原微生物（病毒、細(xì)菌、支原體等）進行核酸水平的檢測。雖然熒光定量PCR是目前病毒分子檢測方面的“金標(biāo)準(zhǔn)”，應(yīng)用廣泛，但依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值，而用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品缺乏統(tǒng)一的計量標(biāo)準(zhǔn)。而數(shù)字PCR則不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此，被科研人員大量應(yīng)用于病毒和致病菌的檢測研究中，如HBV[10-11]、腸病毒[12]、腺相關(guān)病毒[13]、巨細(xì)胞病毒[14]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌[15]、結(jié)核分支杄菌[16]、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌[17]、沙門氏菌[18]、大腸桿菌O157:H7[19]等。

4 結(jié)語

數(shù)字PCR與傳統(tǒng)熒光定量PCR相比具有獨特的技術(shù)優(yōu)勢，實現(xiàn)了單分子DNA絕對定量，能夠精準(zhǔn)分析出目標(biāo)基因的濃度，目前已成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。

雖然目前數(shù)字PCR檢測多處于發(fā)展初期，大多還處于實驗室的研發(fā)階段，沒有真正應(yīng)用到微生物定量檢測中。但是，該方法具有簡單、快捷、靈敏、特異性強且綜合了熒光定量PCR的準(zhǔn)確性及基因芯片的高通量特點，并且不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量，有望成為核酸絕對定量的新標(biāo)準(zhǔn)。今后，應(yīng)該將數(shù)字PCR法與現(xiàn)有的傳統(tǒng)微生物檢測方法相結(jié)合，制定微生物數(shù)字PCR檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，提高樣品中病原菌的檢出率，并推廣應(yīng)用，為微生物檢測提供技術(shù)支持。