李 津，藺旭光，李佳怡

(1.內(nèi)蒙古通遼市家畜繁育指導(dǎo)站，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古通遼市扎魯特旗園林管理局，內(nèi)蒙古 通遼 029100）

近來，養(yǎng)牛業(yè)規(guī)模壯大和集約化的增強(qiáng)，犢牛腹瀉的致病和致死呈上升趨勢。犢牛腹瀉病是犢牛致死原因之一，康復(fù)后，其生產(chǎn)性能受到較大影響。剛出生的牛腹瀉發(fā)病率達(dá)80%，發(fā)病時間短、致死高、難以診斷。犢牛腹瀉是由外界環(huán)境與病原的共同作用、機(jī)體狀態(tài)與病原的相互作用、飼養(yǎng)管理與病原相互作用以及這些因素共同作用的結(jié)果。

1 發(fā)病情況

2016年12月通遼某牛場送檢一頭因腹瀉致死的未斷奶小牛犢。經(jīng)詢問及剖檢懷疑該病例為細(xì)菌性腹瀉。本試驗采用細(xì)菌方法及分子生物學(xué)方法對該致病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。最終達(dá)到確診該病例的目的。

2 實驗室診斷

2.1 病料處理及接種配種培養(yǎng)結(jié)果

對犢牛尸體剖檢，采出十二指腸，挑取腸內(nèi)容物，在LB上涂布接種，再把LB放在恒溫箱培養(yǎng)18～24h。病料腸道內(nèi)容物經(jīng)培養(yǎng)，再經(jīng)劃線分離純化后，菌落菌落呈灰色突出圓形，邊緣不粗糙，且表面光滑。在鮮血瓊脂板上呈現(xiàn)β溶血。在麥康凱上呈現(xiàn)粉紅色。

2.2 菌體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

將培養(yǎng)好的細(xì)菌菌落涂在營養(yǎng)瓊脂平板，劃線分離，經(jīng)恒溫箱24h后，涂片用革蘭氏復(fù)染液染色，油鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)中等大小桿狀，顏色為紅色。判斷該菌為革蘭陰性菌。挑取經(jīng)劃線分離后的單菌落，接于LB內(nèi)。恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)后，留用。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

取100μL細(xì)菌純化培養(yǎng)物滴加到營養(yǎng)瓊脂平板上，用涂菌棒將其涂抹均勻，將舒普深、丁胺卡那霉素、氧氟沙星、紅霉素、左氟沙星、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢拉定（先鋒Ⅵ）、新霉素、阿莫西林、諾氟沙星氯霉素的藥敏紙片分別均勻地貼在瓊脂平板培養(yǎng)基表面。恒溫箱24h，舒普深、氯霉素、丁胺卡那霉素、新霉素有明顯的抑菌圈，其抑菌圈直徑分別為25.6、18.7、13、11.9mm，其余藥物表現(xiàn)為耐藥。該試驗，判定以紙片法藥敏試驗抑菌環(huán)直徑為標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果

提取菌液DNA，根據(jù)文獻(xiàn)內(nèi)容合成PCR引物。反應(yīng)體系條件，94℃預(yù)變性 180s，循環(huán)反應(yīng):95℃30s、56℃30s、72℃延伸30s，30cycle，72℃延伸10min。獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測及凝膠回收。將27f和1492r用16sDNA基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的片段，長度大約是1500bp。

根據(jù)測序序列，使用MEGA5.0軟件將結(jié)果制成系統(tǒng)發(fā)育樹，該分離株與已知大腸桿菌菌株（Eschreichia colistrain CCFM8335）親緣關(guān)系最近。

3 討論

根據(jù)對該病料的一系列試驗表明，該病料感染的是與大腸桿菌（Eschreichia coli strainCCFM8335菌株）親緣最近的菌株。

通過對病料進(jìn)行菌體分離與鑒定。該病例源于養(yǎng)殖場措施不全、小場不規(guī)范投喂藥物等飼養(yǎng)過程不規(guī)范造成，以致呈現(xiàn)出高強(qiáng)度的藥物耐受性。消費者迷惑中，為此買單。持續(xù)下去如此狀況，后果不可想象。規(guī)范養(yǎng)殖必須做到，安全用藥，合理投喂藥物，按時接種疫苗，完善養(yǎng)殖鏈條。

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