慕莉蓉，俞紅梅，許欣，劉穎，惠超杰

糖尿病心肌?。―C）是糖尿病患者所特有的心臟并發(fā)癥，其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未明確[1]。研究顯示，糖尿病可增加心血管疾病發(fā)生率及病死率，在糖尿病動物模型及患者中均可發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡增加，而長期心肌細(xì)胞凋亡增加是導(dǎo)致心力衰竭的一個(gè)重要原因[2,3]，因此，降低糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡具有重要意義。細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白Twinfilin（Twf）是在進(jìn)化上很保守的一個(gè)微絲結(jié)合蛋白。研究顯示，在心肌肥厚中Twf1呈上調(diào)表達(dá)，對心肌細(xì)胞肥大起促進(jìn)作用[4]，這提示Twf1可能影響心肌疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，Twf1對糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。本研究用高糖培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞來探討抑制Twf1表達(dá)對H9c2細(xì)胞凋亡的影響，并初步研究其發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖均購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Twf1、p-IκBα、Bax、TNF-α抗體均購自美國Abcam公司；DCFH-DA購自碧云天；脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司；CCK8試劑購自Dojindo；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基；Lowry法蛋白定量試劑盒購自上海生工；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液（含有10%小牛血清）中，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2恒溫培養(yǎng)箱（95%空氣）中37℃培養(yǎng)，2～3 d后，觀察到細(xì)胞生長密度達(dá)80%以上時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞后傳代。實(shí)驗(yàn)選擇生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞分組處理及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞分為對照組、NC組、高糖組和Twf1-siRNA組。無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞24 h，予以相應(yīng)的處理，對照組使用含5.5 mmol/L的葡萄糖的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；NC組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染無干擾作為的siRNA后用5.5 mmol/L的葡萄糖刺激細(xì)胞24 h；高糖組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染無干擾作為的siRNA后用25 mmol/L的葡萄糖刺激細(xì)胞24 h；Twf1-siRNA組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾Twf1表達(dá)的siRNA后用25 mmol/L的葡萄糖刺激細(xì)胞24 h。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：參照脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d將生長至對數(shù)期的H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔板上，細(xì)胞生長融合達(dá)80%以上時(shí)將無干擾作為的siRNA和干擾Twf1表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱內(nèi)保溫5 h，更換為含有血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 蛋白質(zhì)印跡在各處理組細(xì)胞中加入預(yù)冷的裂解緩沖液，4℃超聲粉粹后離心取上清，上清即為提取的全細(xì)胞蛋白。Lowry法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，上樣量體積含30 μg蛋白，電泳結(jié)束后將目的膠至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜2 h，洗膜，4℃搖床孵育稀釋好的Twf1、p-IκBα、Bax、TNF-α及內(nèi)參GAPDH抗體（均為1:1000稀釋）過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育1～2 h，ECL顯色液避光顯色，凝膠圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，凝膠自動分析軟件分析Twf1、p-IκBα、Bax、TNF-α相對于內(nèi)參GAPDH的蛋白表達(dá)量。1.5 CCK8法檢測各組細(xì)胞活力以每毫升105個(gè)細(xì)胞接種生長至對數(shù)期的細(xì)胞于96孔板，按照1.3分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于測試前在每孔中加入CCK8試劑10 μl，酶標(biāo)儀測定各孔的平均吸光度值（OD值，波長為570 nm）。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率將按照1.3分組的各處理細(xì)胞用胰蛋白消化后制備成單細(xì)胞懸液（105/ml），預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，離心，在沉淀中加入結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，混勻后加入AnnexinV-FITC（250 μg/ml）和PI（250 μg/ml）各5 μl，4℃避光放置10～15 min，上機(jī)，行流式細(xì)胞術(shù)檢測。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞ROS含量將按照1.3分組的各處理細(xì)胞裝入稀釋好的1 ml DCFHDA探針，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育20 min，無血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，轉(zhuǎn)細(xì)胞于流式管中，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（發(fā)射波長為525 nm，激發(fā)波長為488 nm）。熒光強(qiáng)度的大小與ROS水平呈現(xiàn)正相關(guān)，因此可以用熒光強(qiáng)度間接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理組心肌細(xì)胞中Twf1的蛋白表達(dá)NC組Twf1的蛋白表達(dá)與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高糖組和Twf1-siRNA組Twf1的蛋白表達(dá)均高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Twf1-siRNA組Twf1的蛋白表達(dá)低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

2.2 抑制Twf1表達(dá)提高高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力CCK8檢測各組H9c2細(xì)胞活力，高糖組細(xì)胞活力低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Twf1-siRNA組細(xì)胞活力高于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 各處理組心肌細(xì)胞中Twf1的蛋白表達(dá)

2.3 抑制Twf1表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡通過AnnexinV-FITC和PI雙染法，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，NC組、高糖組和Twf1-siRNA組的細(xì)胞凋亡率分別為（1.51±0.56）%、（16.65±1.34）%、（9.02±0.98）%，高糖組細(xì)胞凋亡率高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Twf1-siRNA組細(xì)胞凋亡率低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖2 抑制Twf1表達(dá)提高高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力

圖3 抑制Twf1表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

2.4 抑制Twf1表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中ROS含量熒光強(qiáng)度的大小與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈正相關(guān)，因此用熒光強(qiáng)度可間接反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度，NC組、高糖組和Twf1-siRNA組的相對熒光強(qiáng)度分別為（21.26±2.61）、（67.18±4.32）、（43.56±3.18），高糖組ROS含量高于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Twf1-siRNA組ROS含量低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 抑制Twf1表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中ROS含量

2.5 抑制Twf1表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞NF-κB信號上調(diào)Western blotting檢測NF-κB信號p-IκBα、Bax及TNF-α的蛋白表達(dá)，高糖組p-IκBα、Bax和TNF-α的蛋白表達(dá)均高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Twf1-siRNA組p-IκBα、Bax和TNF-α的蛋白表達(dá)均低于高糖組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 抑制Twf1表達(dá)降低高糖誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞NF-κB信號上調(diào)

3 討論

糖尿病心肌?。―C）是引起糖尿病致死致殘的主要因素之一，也是目前公認(rèn)的特異的、獨(dú)立的心肌疾病。隨著糖尿病發(fā)病率的不斷升高，DC也受到了廣泛的關(guān)注。心肌細(xì)胞的凋亡、肥大和纖維化是DC的主要病理表現(xiàn)，其中，心肌細(xì)胞凋亡在DC形成中有著重要作用[5,6]。已有研究顯示，高糖可引起心肌細(xì)胞的凋亡，但引起凋亡的具體分子機(jī)制尚未明確[7]。細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白Twinfilin（Twf）是在進(jìn)化上很保守的一個(gè)微絲結(jié)合蛋白，哺乳動物有Twf1和Twf2，Twf1主要在心肌細(xì)胞表達(dá)。有研究顯示，Twf1在小鼠心肌細(xì)胞系過表達(dá)可出現(xiàn)蠕蟲狀異常纖維及應(yīng)力纖維減少[8]；心肌細(xì)胞中Twf1表達(dá)升高可引起細(xì)胞表面積增大，并可引起心肌肥厚分子標(biāo)記物表達(dá)的升高；miR-1表達(dá)下調(diào)可引起Twf1表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生及發(fā)展[9]；也有研究指出，miR-30e可通過靶向抑制Twf1而對心肌肥厚進(jìn)行調(diào)控[10]。這些都提示，Twf1可促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。目前，Twf1對糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡的影響還不清楚。本研究結(jié)果顯示，高糖可引起細(xì)胞內(nèi)Twf1表達(dá)升高，抑制Twf1表達(dá)可提高由高糖引起的心肌細(xì)胞活力降低，并降低由高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡增加。這提示抑制Twf1表達(dá)可能對DC起到保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，ROS是細(xì)胞內(nèi)最為重要的一個(gè)氧化代謝自由基，病理狀態(tài)下，ROS的大量蓄積可加重氧化應(yīng)激對核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成的損傷，進(jìn)而破壞細(xì)胞的生理、結(jié)構(gòu)和代謝，最終引起機(jī)體的生理病理學(xué)改變[11,12]。有研究顯示，長期的高血糖可引起糖基化終末產(chǎn)物在心肌中過多沉積及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體表達(dá)升高，糖基化終末產(chǎn)物與糖基化終末產(chǎn)物受體兩者結(jié)合后可通過激活NF-κB等過程引起氧化應(yīng)激[13,14]。本研究結(jié)果顯示，抑制心肌細(xì)胞Twf1表達(dá)可降低由高糖引起的細(xì)胞內(nèi)ROS含量的升高。NF-κB是一個(gè)較為敏感的調(diào)節(jié)免疫、炎癥等的重要的轉(zhuǎn)錄因子，有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號的激活與DC發(fā)生密切相關(guān)，激活的NF-κB可調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-1β等多種細(xì)胞因子和炎癥因子，進(jìn)而參與心肌的炎癥損傷[15-17]。TNF-α可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，DC中TNF-α的表達(dá)升高[18,19]。Bax是Bcl-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，在DC中表達(dá)升高[20]，本研究檢測NF-κB信號磷酸化的IκBɑ及TNF-α和Bax的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制Twf1表達(dá)可顯著降低高糖引起的磷酸化的IκBɑ、TNF-α和Bax的表達(dá)。這提示Twf1可通過下調(diào)NF-κB信號對DC起保護(hù)作用。

綜上所述，抑制H9c2細(xì)胞Twf1基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低及凋亡的增加，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低及NF-κB信號下調(diào)有關(guān)。本研究可能為DC的分子靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，目前尚需要進(jìn)一步的深入研究。