喬永剛， 王勇飛， 陳 亮， 崔芬芬， 曹亞萍， 宋 蕓

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

蒲公英為常用清熱解毒中藥材[1]，也是重要的食藥兼用植物。隨著蒲公英的多元化開(kāi)發(fā)利用，市場(chǎng)需求量增大，蒲公英的規(guī)模化種植也應(yīng)運(yùn)而生[2]。藥蒲公英(TaraxacumofficinaleF. H. Wigg.)株型大，產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)，是中藥材蒲公英主要的栽培物種。栽培植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遭受水分、溫度等條件脅迫，會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3]。藥蒲公英返青早，早春易受“倒春寒”影響，直接影響其產(chǎn)量與品質(zhì)[4]。低溫會(huì)影響植物體內(nèi)滲透壓平衡，破壞膜結(jié)構(gòu)及其組成，影響光合作用[5]。活體葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫挠行结?，可以探測(cè)植物光合作用過(guò)程的變化[6]。為了抵抗低溫脅迫，植物已經(jīng)發(fā)展了許多策略，包括積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化酶活性等方式[7]。植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸可以使細(xì)胞保持水分吸收和膨脹，從而進(jìn)行正常的生理代謝，保護(hù)細(xì)胞免受損害[8]。低溫也導(dǎo)致大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)生成，ROS可引起植物中的脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化損傷[9]。為了避免ROS誘導(dǎo)的氧化損傷，植物可以積累抗氧化酶。過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是植物重要的抗氧化酶，其活性與植物的抗寒性相關(guān)[10]。植物細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其低溫抗性密切相關(guān)，葉片的組織結(jié)構(gòu)對(duì)生長(zhǎng)條件反應(yīng)較為敏感。低溫脅迫會(huì)對(duì)細(xì)胞中各種結(jié)構(gòu)造成傷害，尤其是葉片中細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)[11]。胞質(zhì)分離現(xiàn)象也在低溫脅迫時(shí)經(jīng)常發(fā)生[12]。

目前蒲公英在干旱脅迫[13]、鹽堿脅迫[14]方面的研究較多，低溫脅迫研究較少。本文探究藥蒲公英幼苗在零上低溫脅迫下顯微結(jié)構(gòu)和生理的變化，為揭示藥蒲公英低溫脅迫研究與耐低溫機(jī)制提供細(xì)胞學(xué)與生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用藥蒲公英幼苗為試驗(yàn)材料。藥蒲公英種子為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的“銘賢1號(hào)”藥蒲公英種子。挑選籽粒飽滿(mǎn)的供試種子，將其在25℃蒸餾水中浸泡12 h，播種于裝有蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽(9 cm×9 cm)。在晝溫25±2℃，夜溫20±2℃，光照強(qiáng)度12 000 lx(16 h光照/8 h黑暗)，65%相對(duì)濕度的人工氣候室中培養(yǎng)。出苗后，用Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每營(yíng)養(yǎng)缽定苗1株。在6～7葉期進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1低溫脅迫 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、健康的幼苗進(jìn)行低溫脅迫試驗(yàn)，4℃(16 h光照/8 h黑暗)環(huán)境下分別處理0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h。每組10株，3次重復(fù)。

1.2.2葉片亞顯微結(jié)構(gòu)觀察 分別在藥蒲公英低溫脅迫的0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，取第二節(jié)位葉片，用2.5%戊二醛固定，按范華[15]方法制備透射電鏡樣品，利用透射電子顯微鏡(JEM-100CX II型)觀察并拍照。

1.2.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 使用葉綠素?zé)晒鈨x(OS5p+)對(duì)葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量前暗適應(yīng)30 min。測(cè)定初始熒光值Fo(Initial fluorescence)、最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm(Variable fluorescence / maximal fluorescence)、光系統(tǒng)II(Photosystem II，PSII)潛在光化學(xué)效率Fv/Fo(Variable fluorescence / initial fluorescence)、實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΦPSII(PSII actual photochemical quantum yield)、非光化學(xué)淬滅NPQ(Non-photochemical fluorescence quenchin)以及相對(duì)電子傳遞速率ETR(Electron transport rate)[16]。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4生理指標(biāo)分析 低溫脅迫處理0 h和48 h時(shí)取葉片材料，分別測(cè)量脯氨酸、丙二醛(MDA)的含量、抗氧化物酶(POD、CAT、SOD)的活性以及相對(duì)電導(dǎo)率的大小，測(cè)量方法參照李莎莎等[17]的方法，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2016和SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英葉片細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響

觀察藥蒲公英在不同時(shí)間低溫脅迫后的亞顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下：0 h時(shí)，藥蒲公英葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)中間有大液泡；在細(xì)胞質(zhì)中有圓形線粒體和梭形的葉綠體；葉綠體類(lèi)囊體片層清晰可見(jiàn)；線粒體出現(xiàn)在葉綠體周?chē)?圖1-A)。低溫處理3 h后，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)少量膜泡，線粒體的數(shù)量增加(圖1-B)。處理6 h后，葉綠體形態(tài)開(kāi)始扭曲，類(lèi)囊體片層部分減少，淀粉粒積累明顯(圖1-C)。脅迫12 h后，葉綠體外膜開(kāi)始溶解，基粒片層和類(lèi)囊體片層稀疏(圖1-D)，核膜比較穩(wěn)定(圖1-G)。脅迫24 h后，液泡膜開(kāi)始溶解，線粒體數(shù)量較之前增加，有比較明顯的內(nèi)嵴，線粒體膜變得模糊不清(圖1-E)，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的破裂，說(shuō)明線粒體受傷害較葉綠體小。脅迫48 h后，葉綠體膜和片層溶解嚴(yán)重，液泡膜溶解(圖1-F)；出現(xiàn)比較明顯的胞質(zhì)分離現(xiàn)象(圖1-H)；此外，在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)一種雙層膜的結(jié)構(gòu)(圖1-I)。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，藥公英葉片亞顯微結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，葉片受到損傷。

圖1 不同低溫脅迫處理時(shí)間對(duì)藥蒲公英葉片細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 The influence of low temperature treatment time on ultrastructure of leaves of T. officinale注：A：0 h，B：3 h，C：6 h，D：12 h；E：24 h；F：48 h；G:12 h；H：48 h；I：48 h；Ch：葉綠體；MT：線粒體；V：液泡；CW：細(xì)胞壁；SG：淀粉粒；細(xì)胞核：N；核膜：NMNote:A:0 h;B:3 h;C:6 h;D:12 h;E:24 h;F:48 h;G:12 h;H:48 h;I:48 h;Ch:chloroplast;MT:mitochondrion;V:vacuole;CW:cell wall;SG:starch giains;N:nucleus;NM:nuclear membrane

2.2 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

利用葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定藥蒲公英不同時(shí)間的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。與0 h相比，低溫脅迫3 h時(shí)，F(xiàn)o呈上升趨勢(shì)，在3 h～48 h呈下降的趨勢(shì)，其中在3 h～12 h時(shí)下降緩慢(圖2-A)，F(xiàn)o降低說(shuō)明低溫脅迫可能會(huì)降低藥蒲公英的葉綠素濃度。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo及ΦPSII呈下降的趨勢(shì)，但在6 h～12 h均有較小幅度上升(圖2-B、圖2-C、圖2-D)，說(shuō)明低溫影響PSII光能轉(zhuǎn)化率，使得藥蒲公英PSII的光化學(xué)反應(yīng)速率下降。從圖2-E可以看出，藥蒲公英的ETR在0 h～3 h呈上升趨勢(shì)，3 h～48 h呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明低溫影響藥蒲公英的光合電子傳遞速率的快慢，電子傳遞速率減小，影響其光合作用。NPQ在0 h～12 h呈上升的趨勢(shì)，在12 h～48 h，NPQ呈下降趨勢(shì)(圖2-F)。

圖2 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)葉綠素?zé)晒獾挠绊慒ig.2 The influence of low temperature treatment time on chlorophyll fluorescence parameters of T. officinale注：A：初始熒光值Fo；B：最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm；C：PSII潛在光化學(xué)效率Fv/Fo；D：實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΦPSII；E：相對(duì)電子傳遞速率ETR；F：非光化學(xué)淬滅NPQNote:A:initial fluorescence;B:maximum photochemical quantum yield;C:PSII potential photochemical efficiency;D:actual photochemical quantum yield;E:electron transport rate;F:non-photochemical fluorescence quenching

2.3 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英生理特性的影響

通過(guò)測(cè)量脯氨酸、MDA含量、POD、CAT、SOD活性以及相對(duì)電導(dǎo)率的大小，結(jié)果表明：低溫脅迫48 h，葉片中MDA、相對(duì)電導(dǎo)率的含量以及脯氨酸的水平與0 h相比增加(圖3-A、圖3-B、圖3-C)，說(shuō)明低溫脅迫下，藥蒲公英葉片細(xì)胞膜受到損傷，并且滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸在藥蒲公英抵抗低溫脅迫過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。低溫處理48 h后，葉片的CAT、SOD活性與0 h相比下降(圖3-D、圖3-E)，POD活性升高(圖3-F)。說(shuō)明藥蒲公英抗氧化酶對(duì)低溫脅迫有一定的保護(hù)作用。

圖3 低溫脅迫對(duì)藥蒲公英生理特性的影響Fig.3 Effects of low temperature on physiological characteristics of T. officinale

3 討論

本研究中探討了低溫脅迫對(duì)藥蒲公英葉片亞顯微結(jié)構(gòu)和光合作用的影響。在進(jìn)行低溫脅迫處理后，藥蒲公英的葉片逐漸萎縮，葉片細(xì)胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，葉片細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)分離，細(xì)胞液外滲減少，受到一定損害。另外，藥蒲公英葉片線粒體在葉綠體周?chē)植疾⑶覕?shù)量增加，葉綠體中的淀粉粒數(shù)量也增加，這些可能有助于緩解低溫造成的葉片損傷。在細(xì)胞中觀察到一些雙層膜結(jié)構(gòu)，猜測(cè)這種未知結(jié)構(gòu)對(duì)藥蒲公英應(yīng)對(duì)低溫脅迫有重要的作用，需進(jìn)一步深入研究。馬鈴薯[3]、紫花苜蓿[18]以及棉花[19]在低溫脅迫時(shí)也有相似的結(jié)構(gòu)變化。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是反映植物體內(nèi)光合作用變化的指標(biāo)[20]。Fo可以反應(yīng)植物葉綠素濃度[21]，且其變化與PSII反應(yīng)中心的失活有關(guān)[22]。試驗(yàn)結(jié)果表明藥蒲公英Fo在3～48 h下降，可能由于低溫破壞了PSII反應(yīng)中心，從而使葉綠素含量降低。Fv/Fm代表PSII反應(yīng)中心吸收光量子的最大比例，其主要是用來(lái)反映PSII復(fù)合物的光抑制傷害程度[23]。此外，藥蒲公英低溫脅迫后Fv/Fm、Fv/Fo及ΦPSII基本呈下降的趨勢(shì)，PSII的光化學(xué)反應(yīng)速率下降可能與光抑制有關(guān)。ETR的高低可以反映出其潛在最大光合能力的大小。在正常情況下，植物的ETR值通常處于動(dòng)態(tài)平穩(wěn)狀態(tài)，但在遭受低溫等逆境脅迫后，ETR出現(xiàn)下降[23]。低溫脅迫使藥蒲公英的電子傳遞速率降低，減弱CO2的同化能力，限制光合碳代謝的電子供應(yīng)和光合效率，產(chǎn)生光抑制，進(jìn)而作用于其光合作用，原因可能是低溫導(dǎo)致葉綠體類(lèi)囊體的膜結(jié)構(gòu)或構(gòu)象發(fā)生變化，最終對(duì)PSII的功能產(chǎn)生抑制[24]。植物遭受低溫脅迫時(shí)，其自我保護(hù)機(jī)制被激發(fā)，大量由天線色素吸收的光能轉(zhuǎn)化為熱能散發(fā)，葉綠體等光合作用器官的損傷程度減小[25]。NPQ能體現(xiàn)PSII反應(yīng)中心內(nèi)將光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力，它是一種自我保護(hù)機(jī)制，對(duì)光合器官具有保護(hù)作用[26]。本研究中藥蒲公英的NPQ在脅迫12 h內(nèi)呈升高趨勢(shì)，可能是藥蒲公英在低溫脅迫中啟動(dòng)了自我保護(hù)機(jī)制，其天線色素將吸收的光能以熱能形式散發(fā)，保護(hù)了自身的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。但在脅迫12 h后呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明其自我保護(hù)有一定的限度，超過(guò)這個(gè)度將會(huì)影響光合作用。NPQ降低可能由于低溫條件下光合相關(guān)酶的活性降低，從而影響光反應(yīng)。

植物可以通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來(lái)增強(qiáng)其抗脅迫的能力。正常生長(zhǎng)環(huán)境下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量低，但遭受低溫、水分脅迫等逆境時(shí)，游離脯氨酸會(huì)大量積累，且積累含量與植物抗逆性密切相關(guān)[27]。藥蒲公英脯氨酸含量在低溫脅迫后增加，其增加可能會(huì)增強(qiáng)植物的抗逆性。有研究表明植物在逆境環(huán)境中膜結(jié)構(gòu)會(huì)受損甚至破壞，導(dǎo)致其通透性增大，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)出現(xiàn)外滲的狀況[28]，本研究中藥蒲公英的電導(dǎo)率、MDA增大恰好反應(yīng)其膜結(jié)構(gòu)受損的狀態(tài)。此外，植物抗氧化酶活性的增強(qiáng)，可以增強(qiáng)其膜保護(hù)系統(tǒng)，降低膜脂過(guò)氧化的程度，使其抗逆性提高[29]。藥蒲公英在低溫脅迫后，POD的活力升高，可見(jiàn)POD在低溫脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著積極作用；SOD和CAT的活力呈下降趨勢(shì)，這可能是由于脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，蒲公英體內(nèi)的自由基含量增加活性氧平衡系統(tǒng)遭到破壞，致使酶活性下降。低溫環(huán)境時(shí)紫花苜蓿的抗氧化酶活性也有類(lèi)似變化[29]。

4 結(jié)論

零上低溫脅迫影響藥蒲公英葉片亞顯微結(jié)構(gòu)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及生理特性。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，藥蒲公英葉片膜通透性增加，光合能力下降，亞顯微結(jié)構(gòu)受到明顯破壞，葉片受到損傷，影響生長(zhǎng)發(fā)育。