朱艷麗，杜井峰，蘇德望，劉亮，程卓鑫，張雪梅

(1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154002；2佳木斯市腫瘤醫(yī)院)

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率均居所有惡性腫瘤的前三位[1]。胃癌的病因尚不完全清楚，目前認(rèn)為幽門螺桿菌(Hp)感染與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而且WHO已將其列為Ⅰ類致病原[2]。Hp感染在誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，可刺激或抑制微小RNA(miRNA)基因表達(dá)，有可能作為抑癌基因或促癌基因參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[3,4]。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)蛋白是Hp Cag致病島上CagA基因編碼的產(chǎn)物，亦是Hp感染導(dǎo)致宿主炎性反應(yīng)的重要效應(yīng)蛋白。微小RNA-17(miR-17)可作為促癌基因參與腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[5,6]。但其在胃癌組織特別是Hp陽性胃癌組織中的表達(dá)變化鮮見報(bào)道。2016年1月～2017年9月，本研究觀察了miR-17在Hp相關(guān)胃癌組織中的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集同期就診于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院的胃癌患者75例，均經(jīng)病理檢查確診，其中Hp陽性48例、Hp陰性27例。48例Hp陽性胃癌患者中，男30例、女18例，年齡>60歲16例、≤60歲32例；腫瘤直徑：≤5 cm 28例，>5 cm 20例；組織分化程度：中度14例，低度34例；臨床分期(國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)第8版)[7]：Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期20例；Borrmann分型：Ⅰ、Ⅱ型26例，Ⅲ、Ⅳ型22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。本研究經(jīng)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

1.2 細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)mRNA表達(dá)檢測(cè) 取手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、染色，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)CagA mRNA表達(dá)。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。正向引物：5′-GATAACAGGCAAGCTTTGAGG-3′；反向引物：5′-CTGCAAAGATTGTTTGCGAGA-3′?？侱NA提取：取胃癌組織標(biāo)本，石蠟塊切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，使用消化液消化，采用酚-氯仿提取DNA。按PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性60 s、50 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s共30個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CagA mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-17表達(dá)檢測(cè) 總RNA提?。喝∥赴┙M織及癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>10 cm)標(biāo)本，于液氮中碾磨成粉狀，根據(jù)TRIzol說明提取組織總RNA，使用DEPC處理后蒸餾水溶解。經(jīng)Biophotometer分光光度計(jì)鑒定，A260/A280為1.8～2.0，說明提取的總RNA濃度與純度合格。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-17相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 Hp陽性、陰性胃癌組織CagA mRNA表達(dá)比較 Hp陽性、陰性胃癌組織CagA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為6.061±0.712、1.024±0.235。Hp陽性胃癌組織CagA mRNA相對(duì)表達(dá)量高于Hp陰性胃癌組織(t=35.593,P<0.05)。

2.2 Hp陽性、陰性胃癌組織miR-17表達(dá)比較 Hp陽性胃癌組織、癌旁組織miR-17表達(dá)均高于Hp陰性胃癌組織及癌旁組織(P均<0.01)；Hp陽性、陰性胃癌組織miR-17表達(dá)高于癌旁組織(P均<0.01)。見表1。

表1 Hp陽性、陰性胃癌組織及癌旁組織miR-17表達(dá)比較

注：與Hp陰性比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05。

2.3 miR-17表達(dá)與Hp陽性胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、組織分化程度Hp陽性胃癌患者miR-17表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；腫瘤直徑>5 cm，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期，Borrmann分型Ⅲ、Ⅳ型以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-17表達(dá)高于腫瘤直徑≤5 cm，臨床分期Ⅰ、Ⅱ期，Borrmann分型Ⅰ、Ⅱ型以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-17表達(dá)與Hp陽性胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 胃癌組織miR-17表達(dá)與CagA表達(dá)的關(guān)系 胃癌組織miR-17表達(dá)與CagA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.564,P<0.01)。

2.5 miR-17表達(dá)與Hp陽性胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)miR-17表達(dá)差異，以差異大于2倍為分界點(diǎn)將Hp陽性胃癌患者分為高表達(dá)30例和低表達(dá)18例。miR-17高表達(dá)Hp陽性胃癌患者生存時(shí)間為(27.65±4.12)個(gè)月，miR-17低表達(dá)Hp陽性胃癌患者生存時(shí)間為(34.74±5.32)個(gè)月。miR-17高表達(dá)Hp陽性胃癌患者平均生存時(shí)間明顯短于miR-17低表達(dá)Hp陽性胃癌患者(t=5.170,P<0.05)。

3 討論

miRNA是一類長度為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，具有高度保守性、時(shí)序性與組織特異性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。因miRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易被降解，被認(rèn)為是具有廣泛應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物，可用于腫瘤早期篩查、預(yù)后判斷[8，9]。miR-17定位于人13號(hào)染色體，屬于miR-17-92基因家族一員，在宮頸癌[10]、膽管癌[11]、食管癌[12]等組織或患者血清中高表達(dá)，可能作為一種促癌基因，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13，14]。

Hp為單級(jí)、多鞭毛、螺旋形彎曲的革蘭陰性菌，能分泌毒力因子，可寄居于胃黏膜表面，能刺激胃黏膜炎癥、免疫反應(yīng)。Hp致病性取決于細(xì)菌毒力因子與宿主細(xì)胞應(yīng)答等相關(guān)因素[15，16]。CagA蛋白是Hp Cag致病島上CagA基因編碼的產(chǎn)物，亦是Hp感染導(dǎo)致宿主炎性反應(yīng)的重要效應(yīng)蛋白，可引起胃黏膜慢性炎癥損傷，增加胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[17]。馬連君等[18]研究報(bào)道，Hp陽性胃癌組織CagA mRNA表達(dá)高于Hp陰性胃癌組織。本研究結(jié)果與之相符，并發(fā)現(xiàn)胃癌組織miR-17表達(dá)與CagA mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，Hp陽性胃癌組織、癌旁組織miR-17表達(dá)高于Hp陰性胃癌組織及癌旁組織，Hp陽性、陰性胃癌組織miR-17表達(dá)高于Hp陽性、陰性癌旁組織，提示Hp感染可誘導(dǎo)刺激miR-17表達(dá)。

有研究表明，miR-17可通過p21p、53INP1等途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[19]，但這種作用在不同病理特征患者中效果各不相同[20，21]。本研究結(jié)果表明，Hp陽性胃癌患者miR-17表達(dá)與腫瘤直徑、臨床分期、Borrmann分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與姜雙等[22]報(bào)道類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-17高表達(dá)者Hp陽性胃癌中患者生存時(shí)間明顯短于miR-17低表達(dá)Hp陽性胃癌者，說明miR-17可能參與Hp相關(guān)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，miR-17在Hp相關(guān)胃癌組織中的表達(dá)異常升高，且與腫瘤直徑、臨床分期、Borrmann分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后有關(guān)。miR-17有可能作為Hp相關(guān)胃癌早期診斷及預(yù)后判斷的候選標(biāo)志物。