陳慶勇，王娜娜，曹璋，何雙，吳淑華，張騫，李紅

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其早期癥狀隱匿，約80%患者發(fā)現(xiàn)時已屬于進展期。近年來，在胃癌手術(shù)治療、化療以及放療方面均取得了較大進展，但胃癌術(shù)后5年生存率仍不理想。目前，胃癌已成為危害我國人民群眾身體健康的重大公共衛(wèi)生問題之一[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指轉(zhuǎn)錄本超過200個核苷酸的非編碼RNA，其本身不編碼蛋白。牛磺酸上調(diào)基因1(TUG1)是lncRNA的一種，近年研究發(fā)現(xiàn)，其在多種惡性腫瘤中異常表達，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2，3]。p53是一種常見的抑癌基因，在調(diào)控腫瘤細胞周期過程中具有重要作用。本研究觀察了TUG1在胃腺癌組織中的表達變化，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，進一步分析TUG1表達與p53表達的相關(guān)性，從而為胃腺癌的預(yù)后評估及治療尋找新的靶標。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2016年1～7月手術(shù)切除的胃腺癌組織及其癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>2 cm)108例份，液氮中保存。標本來源患者男64例、女44例，年齡38～79歲、中位年齡61歲；腫瘤直徑2.5～11.0 cm，平均7 cm；臨床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期25例，Ⅲ期58例，Ⅳ期13例。所有患者為首診胃癌，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實為腺癌，且術(shù)前未行任何抗腫瘤治療。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 主要試劑 TRIzol、cDNA合成試劑盒及定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑均購自美國Invitrogen公司。TUG1上游引物：5′-TCAAGACCTGGACCTGGAAC-3′；下游引物：3′-AGTTTGCACTGAGGGTCTGG-5′。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。所有引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。p53單克隆抗體購自福建邁新生物技術(shù)有限公司；SP試劑盒及DAB顯色試劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.3 胃腺癌組織TUG1檢測

1.3.1 RNA提取 從液氮中取出組織，剪取約100 mg，加入TRIzol 1 mL，用勻漿器勻漿。將勻漿后樣品置于25 ℃水浴鍋中孵育5 min，以便核酸蛋白復(fù)合體完全解離，其余步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3.2 RNA濃度和純度測定 取RNA樣品2 μL，用1×TE緩沖液稀釋10倍，測定樣品在260、280 nm波長處的吸光度(A)值。RNA濃度=A260×稀釋倍數(shù)×40 ng/μL。A260/A280為1.8～2.1，表明提取的RNA質(zhì)量合格，符合后續(xù)實驗要求。

1.3.3 cDNA合成 取RNA 0.8 μg、0.5 μg/μL Oligo(dT)18 1 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mix 1.6 μL，加無RNA酶的H2O至總體積14.5 μL。將混合液置于65 ℃水浴5 min,冰上放置2 min。短暫離心后，在離心管中依次加入RT反應(yīng)液5×First-Strand Buffer 4 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、RNase ihibitor 0.3 μL、SuperScript Ⅲ RT 0.2 μL，37 ℃恒溫靜置1 min；混勻，依次50 ℃溫育60 min、70 ℃溫育15 min，獲得cDNA待用或置于-20 ℃保存。

1.3.4 實時熒光定量PCR 將所有cDNA樣品分別配置real-time PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 5 μL，10 μmol/L PCR特異性上下游引物各0.5 μL，加H2O至總體積8 μL。輕彈管底，使溶液充分混合，5 000 r/min短暫離心，轉(zhuǎn)入PCR反應(yīng)管內(nèi)；再加入cDNA 2 μL，然后進行real-time PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s共40個循環(huán)；擴增反應(yīng)結(jié)束，95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s，并從60 ℃緩慢加熱至99 ℃。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，其中高于均值為高表達、低于均值為低表達。

1.4 胃腺癌組織p53表達檢測 采用免疫組化法。標本全部經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，按免疫組化SP法染色。所有操作步驟按試劑盒說明書進行。p53陽性著色定位于細胞核，呈黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機選取10個高倍(400×)視野，每視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞比例綜合判斷結(jié)果。細胞染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例評分：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩項得分乘積≥4為陽性表達。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織及癌旁正常組織TUG1表達比較 胃腺癌組織TUG1相對表達量為2.36±1.01、高表達90例(83.3%)，高于癌旁正常組織的0.93±0.54、18例(16.7%)，二者比較P均<0.01。

2.2 胃腺癌組織TUG1表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 TUG1相對表達量在胃腺癌低分化者高于高分化者，浸潤深度T3、T4者高于T1、T2者，有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，有遠處轉(zhuǎn)移者高于無遠處轉(zhuǎn)移者，臨床分期高者高于臨床分期低者(P均<0.05)，但不同年齡、性別、腫瘤直徑及有無脈管侵犯、神經(jīng)侵犯患者TUG1相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 胃腺癌組織TUG1表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃腺癌組織及癌旁正常組織p53表達比較 胃腺癌組織p53陽性表達率為61%(66/108)，癌旁正常組織為39%(42/108)，二者比較P<0.01。

2.4 胃腺癌組織TUG1表達與p53表達的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，TUG1高表達與p53陽性表達呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.204，P<0.05)。見表2。

表2 胃腺癌組織TUG1表達和p53表達的關(guān)系

3 討論

胃癌的發(fā)生一般經(jīng)歷慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、上皮內(nèi)瘤變等多個階段，最終發(fā)展為進展期胃癌。在整個過程中，環(huán)境、飲食等因素發(fā)揮重要作用，同時伴隨著多種癌基因激活、抑癌基因失活或缺失等改變。

lncRNA沒有完整的開放閱讀框架,不編碼蛋白質(zhì),以RNA的形式發(fā)揮作用。越來越多研究表明，lncRNA在細胞代謝過程中具有重要作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、侵襲等[4，5]。

TUG1在人類各種組織細胞中廣泛表達，是調(diào)控視網(wǎng)膜及神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育的必需基因，在小鼠大腦皮層發(fā)育的多個關(guān)鍵時期均能檢測到高表達[6]。研究表明，TUG1在非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、肝細胞癌、膽管癌、B細胞淋巴瘤等組織中異常表達[7～9]。Baratieh等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TUG1在胃癌組織中表達顯著上調(diào)，且與患者臨床病理特征密切相關(guān)。Zhang等[11]研究表明，TUG1在胃癌組織中表達升高，其表達變化能夠促進胃癌細胞增殖。Isin等[12]研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者血漿TUG1水平明顯高于體檢健康者。Ren等[13]研究表明，在胃癌細胞BGC-823和SGC-7901中，TUG1可通過負性調(diào)節(jié)miRNA-145-5p，促進胃癌細胞的增殖、侵襲能力。但也有研究發(fā)現(xiàn)，TUG1在多種惡性腫瘤組織中低表達。Zhang等[14]研究表明，在非小細胞肺癌組織中TUG1表達明顯低于癌旁正常組織，TUG1低表達與腫瘤患者預(yù)后差、腫瘤大小及TNM分期密切相關(guān)，且TUG1可作為非小細胞肺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。Fan等[15]研究表明，TUG1在乳腺癌組織中低表達，且與突變型p53表達及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TUG1在不同腫瘤中的表達不一致，我們認為可能與各腫瘤的病因和發(fā)病機制不同有關(guān)。本研究選取108例份胃腺癌組織及癌旁正常組織，經(jīng)real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，TUG1在胃腺癌組織中的高表達率及相對表達量均高于癌旁正常組織；進一步分析發(fā)現(xiàn)，TUG1高表達與患者腫瘤大小、浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)。

TUG1啟動子包含p53結(jié)合位點，可以由p53直接誘導(dǎo)表達，故p53對于TUG1表達具有重要的調(diào)控作用。p53是一種抑癌基因，按基因型不同，可分為野生型和突變型，其突變型由于空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，失去了抑癌基因作用，從而能促進腫瘤生長[16]。但在胃腺癌組織中鮮見TUG1表達與p53表達關(guān)系的報道。本研究結(jié)果顯示，在胃腺癌組織中p53陽性表達率為61%，且與TUG1高表達呈正相關(guān)關(guān)系。由于本研究所選病例數(shù)相對較少，其結(jié)論是否準確還需要大樣本量進一步驗證。有研究結(jié)果表明，TUG1可上調(diào)HOBX7表達，而HOBX7啟動子能與PRC2的關(guān)鍵分子EZH2結(jié)合。有研究認為，TUG1介導(dǎo)的對腫瘤細胞生長調(diào)控作用部分歸因于對HOXB7的調(diào)節(jié)，從而參與AKT和MAPK信號通路[14]。本研究雖然發(fā)現(xiàn)TUG1高表達與p53陽性表達具有相關(guān)性，但其具體作用機制尚不清楚，有待于我們進一步研究。

綜上所述，TUG1在胃腺癌組織中高表達，其在胃腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有癌基因作用，且與腫瘤組織分化程度、浸潤深度及臨床分期密切相關(guān)。此外，TUG1高表達與p53陽性表達呈正相關(guān)關(guān)系。因此，檢測TUG1和p53表達，將有助于評估胃腺癌臨床分期及患者預(yù)后。