沙秀芬，彭 芳，陶 珊，吳 宇，劉繼明，張 超，李 群*

(1 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101；2 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，成都 610300；3 國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系成都試驗(yàn)站,成都 610300；4 彭州市農(nóng)林局，成都 611942)

丹參(Salviamiltiorrhiza)屬唇形科鼠尾草屬植物，主要產(chǎn)于河北、四川、山西、陜西、山東、河南等地，其根和根莖可入藥，具有活血祛瘀，涼血消癰，養(yǎng)血安神等效用，為婦科用藥，主治子宮出血、月經(jīng)不調(diào)、血瘀、腹痛、經(jīng)痛、經(jīng)閉、廟痛，屬于中國(guó)傳統(tǒng)大宗中藥材。目前以丹參為主的復(fù)方丹參注射液、復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參片等多種復(fù)方制劑，被臨床上廣泛用于冠心病、心絞痛、心肌梗塞和心腦血管系統(tǒng)疾病[1]的治療。同時(shí)，丹參還具有抗腫瘤[2-3]、抗菌抗炎[4]、保護(hù)器官[5]等作用，是臨床應(yīng)用最廣泛的藥材之一。

近年來(lái)，不少學(xué)者運(yùn)用不同的分子標(biāo)記方法對(duì)丹參主要產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的丹參個(gè)體遺傳多樣性豐富，但各地遺傳特性不一致。郭寶林等[6]運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)主產(chǎn)區(qū)的9個(gè)丹參居群樣本進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果顯示，丹參居群內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性且不同地區(qū)間存在差異；宋振巧等[7]利用EST-SSR分子標(biāo)記對(duì)4個(gè)產(chǎn)地的80個(gè)丹參種質(zhì)資源進(jìn)行了多樣性水平分析和聚類(lèi)分析，證明EST-SSR可有效檢測(cè)丹參的遺傳多樣性，但其遺傳距離與地理位置未達(dá)顯著相關(guān)性；Zhang等[8]利用ISSR標(biāo)記分析了不同形態(tài)丹參種質(zhì)的遺傳多樣性，結(jié)果顯示不同形態(tài)丹參材料間存在較高的遺傳多樣性。相對(duì)于以上的標(biāo)記，SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記是由1～6 bp核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，因具有共顯性遺傳、多態(tài)性信息含量豐富、物種間轉(zhuǎn)移性好、可重復(fù)性好和操作性簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的研究，王海等[9]采用丹參葉綠體基因的SSR分子標(biāo)記分析了全國(guó)31個(gè)不同丹參居群的遺傳特性，認(rèn)為丹參的遺傳變異以種群間為主導(dǎo)，丹參種質(zhì)間存在廣泛的基因交流，并建議保護(hù)道地產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)特性。但是，目前已開(kāi)發(fā)的適用于丹參葉綠體和線粒體基因組的SSR標(biāo)記較少。因此本研究利用丹參葉綠體和線粒體基因組開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，并對(duì)61份丹參進(jìn)行遺傳多樣性和近緣物種通用性分析。

1 材料和方法

1.1 材 料

所有試驗(yàn)材料均種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所(表1)。每個(gè)材料取1～2片幼嫩葉片，冷凍于-80 ℃冰箱中備用。然后，下載唇形科全部的葉綠體、線粒體基因組序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/?report=5#!/organelles/Labiatae)，用于電子PCR(Electronic PCR，e-PCR)生物信息學(xué)跨物種分析。

1.2 方 法

1.2.1基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[10]的CTAB方法并稍加修改(65 ℃水浴45 min；加150 μL ddH2O溶DNA)提取DNA。提取的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度，將合格的DNA樣品稀釋至50 ng/μL用于SSR反應(yīng)。

1.2.2SSR位點(diǎn)的搜索及引物設(shè)計(jì)使用MISA軟件(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)搜索SSR位點(diǎn)。設(shè)置搜索參數(shù)用于檢測(cè)單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR基序，分別至少重復(fù)10、6、5、5、5和5次。使用Primer3軟件對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)?；谝韵聟?shù)設(shè)計(jì)引物組：GC含量40%～60%，Tm 50～60 ℃，引物長(zhǎng)度20～24 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～250 bp。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3SSR引物的篩選為篩選出擴(kuò)增效率好的cpSSR、mtSSR引物，選擇10個(gè)DNA樣品，用設(shè)計(jì)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL(Mix 10 μL，引物2 μL，ddH2O 6 μL，模板DNA 2 μL)。反應(yīng)程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4SSR標(biāo)記的驗(yàn)證篩選出多態(tài)性好的引物用61份丹參樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為20 μL(DNA模板2 μL、引物2 μL(稀釋400倍)、dNTP 2 μL(稀釋4倍)、ddH2O 12 μL、Buffer 2 μL、Taq酶0.2 μL)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.5數(shù)據(jù)分析毛細(xì)管凝膠電泳圖結(jié)果有條帶記為1，無(wú)條帶記為0。利用NTSYS-pc2.1軟件進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)構(gòu)建樹(shù)形圖。利用POPGENE1.31軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)等多樣性指標(biāo)。用PIC_CALC軟件分析多態(tài)性含量(PIC)。利用e-PCR進(jìn)行SSR的跨物種性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參cpSSR和mtSSR重復(fù)基元特征分析

使用MISA軟件搜索丹參線粒體、葉綠體基因組序列的SSR位點(diǎn)，共獲得32個(gè)cpSSR位點(diǎn)，24個(gè)mtSSR位點(diǎn)，不同核苷酸重復(fù)基元的SSR數(shù)量間存在明顯差異(表2)。其中，單核苷酸重復(fù)基元A/T的mtSSR位點(diǎn)共17個(gè)，占mtSSR位點(diǎn)總數(shù)的70.8%；二核苷酸重復(fù)基元(AG/CT、AT/AT)和三核苷酸重復(fù)基元(AAG/CTT、AAT/ATT)，分別占mtSSR位點(diǎn)總數(shù)的12.5%和16.7%。而cpSSR位點(diǎn)的單核苷酸重復(fù)基元A/T，占cpSSR位點(diǎn)總數(shù)的96.9%，二核苷酸重復(fù)基元AT/AT，占mtSSR總數(shù)的3.1%。沒(méi)有篩選出全部由G/C堿基構(gòu)成的SSR位點(diǎn)。

2.2 引物的篩選

為了初步篩選出SSR引物，用56對(duì)引物在10個(gè)DNA樣品中進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果(圖1)顯示，34對(duì)引物能在7個(gè)以上的樣品中成功擴(kuò)增出條帶，具有較高的穩(wěn)定性和多態(tài)性，能夠用于SSR標(biāo)記的驗(yàn)證。將篩選出的34對(duì)引物對(duì)61份丹參樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳檢測(cè)篩選出23對(duì)擴(kuò)增效果好、位點(diǎn)數(shù)量適中的cpSSR和mtSSR引物，進(jìn)一步用于丹參遺傳多樣性分析，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，其中19個(gè)SSR位點(diǎn)出現(xiàn)在丹參葉綠體基因組和線粒體基因組的非編碼區(qū)UTR區(qū)域，4個(gè)SSR位點(diǎn)出現(xiàn)在CDS編碼區(qū)，分別是引物cp21p、cp26p、mt4p和mt21p。

2.3 丹參遺傳多樣性分析

2.3.1SSR標(biāo)記多態(tài)性分析用篩選的23對(duì)引物對(duì)61個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)到23個(gè)位點(diǎn)，均為多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)百分比率為100%(表4)。每一對(duì)引物檢測(cè)到觀察等位基因數(shù)為2，有效等位基因數(shù)范圍為1.103～1.987，平均值為1.566。引物cp25p最多，為1.987，其次是引物mt6p和cp5p，有效等位基因數(shù)均為1.913，引物mt9p有效等位基因數(shù)最少，為1.103。

在群體遺傳多樣性分析中(表4)，觀測(cè)雜合度(Ho)在0.499～0.906之間，平均為0.654，引物mt9p最高，cp25p最低；期望雜合度(He)在0.094～0.501之間，平均為0.346，引物cp25p最高，mt9p最低；Shannon’s指數(shù)(I)為0.196～0.690，平均為0.519，引物cp25p最高，mt9p最低。標(biāo)記的多態(tài)信息含量(PIC)介于0.089～0.373，平均為0.278。其中0.250

表2 丹參中不同SSR重復(fù)基序的量

M. DNA markerⅠ；10份材料編號(hào)同表1圖1 引物cp25p、cp29p、cp30p對(duì)10份材料的擴(kuò)增結(jié)果M. DNA markerⅠ; The 10 variety codes were the same as in Table 1Fig.1 Amplification effect of primer cp25p, cp29p, cp30p on 10 materials

引物名稱(chēng)Primer name 重復(fù)基序Repeat motif引物序列Primer sequence (5'→3')退火溫度Tm/℃擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度Amplification product length/bp基因組中位置Genomic locationcp1p(A)10F:TAGCCGCACTTAAAAGCCGAR:TCCATTCATTTTTCTGTTTCGAATTCA56.952.5232(trnK-UUU)-rps16基因間區(qū) Intergeniccp2p(A)11F:AATGATCCGGGGCGTAATCCR:CCCTCTCTTTCCGTTTCCGT57.757.3213atpA-atpF基因間區(qū) Intergeniccp5p(A)10(A)15F:GGCTCTCACGCTCAATTCCTR:CGGCGACCTATGCCTTATGT57.757.5243(trnG-UCC)-(trnfM-CAU)基因間區(qū) Intergeniccp8p(T)11F:CGGTGGTATCAAAACGCCACR:TTCATTCCCGAGGAAGTGCA57.156.5234rps4-(trnT-UGU)基因間區(qū) Intergeniccp10p(A)11F:ACCTTTGCGTCTTCCTTGGAR:CAGTCCCGACGGATCCAATA56.756.7240psbM-(trnD-GUC)基因間區(qū) Intergeniccp11p(A)15F:GGAGAAGATGCGGGTTCGATR:CCTTGAGGTCACGGGTTCAA57.557.6247rps8-rpl14基因間區(qū) Intergeniccp21p(T)13F:ATTTGACCTCGTATCCGGCGR:CCCTCGGTTGATCTTGGTTGA57.757.3122rpoC2cp25p(T)10F:GTCAAATACATGAATGAAGGAAAAGGAR:CGTTAGCCCATACTGCTCCA52.757.2181rps4-(trnT-UGU)基因間區(qū) Intergeniccp26p(T)10F:GACTTTGATTCGCGGCACTCR:CGTTTCCAAAGAGGTTCGTTGT57.155.6118clpPcp30p(T)11F:AATCAAGCCACGACCCTCACR:CGGTTACCGGTCTCAATAATTGA57.954.4209ndhG-ndhI基因間區(qū) Intergenicmt2p(A)11F:AAAGCCCCGCACCTCATTAAR:CTGGCTGGGAGCTGTATGAG57.158.2161orf117a-mttB基因間區(qū) Intergenicmt4p(A)10F:TCCTTCCACCGGCCCTTATAR:TCAACGGTTCTTCGGCCTAC58.157.5227orf154amt6p(T)10F:GCAGCACACCAGACGAAAAGR:GTTCAGGAGCTCCTTGCGTA57.357.3242orf137-(trnQ-UUG)基因間區(qū) Intergenicmt7p(A)10F:CCGAATGAATATCCCGCGGAR:CCGCCTTTTTGCCAACATCA57.656.8194atp4-(trnI-CAU)基因間區(qū) Intergenicmt9p(T)11(A)11F:GAACGGTCGGTAGCTGCTTAR:CTCGTAGTACCTGCTAGCGC57.358.0142orf117a-mttB基因間區(qū) Intergenicmt11p(T)10F:GCCCTTCAACCACCTCATCTR:TCTATCGAGACATTGCGGGC57.657.5238orf182b-orf119a基因間區(qū) Intergenicmt12p(TA)6F:GCGTTGGTACCACGCTCTATR:AGCTATACCACCAGTCTGTTTTCT57.655.2237orf154amt13p(TA)7F:GAAAGGGCCGCTTGCTTAAAR: GGAAAGAGGAGGCCTTTGCT56.357.8192ccmC-rpl2基因間區(qū) Intergenicmt14p(TTC)5F:GCGTTGTTGGGTGGAATTCCR:TCCAAACCTCCTCTTCCCCA57.558.3177orf99c-orf139基因間區(qū) Intergenicmt16p(A)10F:TCTAACCGATCCGCCCAGTAR:ACGATCCTGTCTCAGAGGCT57.957.9243atp6-orf103a基因間區(qū) Intergenicmt19p(A)10F:CAGAGCGAGTCGAAGTGTGTR:CGTAACTGAGCGGTGGACTT57.457.5216orf103b-orf108b基因間區(qū) Intergenicmt21p(A)10F:GAAGAGTGCACGTCCGAAGAR:ACCTACGTCATTCGACTCGC57.457.2232orf105-nad7基因間區(qū) Intergenicmt22p(T)11F:CGGACCCTCGATTCGATTGTR:GCTGCAAGACCAAAACAGGG57.457.5121ccmB-rpl10基因間區(qū) Intergenic

2.3.2聚類(lèi)分析運(yùn)用NTSYS-pc2.1軟件對(duì)61份丹參進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果(圖2)顯示，在相似性系數(shù)為0.54處可分為兩大類(lèi)群，四川省中江縣7號(hào)材料獨(dú)立聚為第一大類(lèi)群；剩余的丹參聚為第二大類(lèi)群。第二大類(lèi)群在0.64處又可分為6個(gè)亞群，分為亞群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。四川省、陜西省、山東省和9份中間材料聚在第Ⅰ亞群；安徽省、山西省和中間材料16號(hào)聚在亞群Ⅱ；四川省中江縣5號(hào)小葉丹參單獨(dú)聚為Ⅳ亞群。由圖2可見(jiàn)，四川丹參在5個(gè)亞群中均有，說(shuō)明四川丹參的遺傳多樣性豐富，而且同一個(gè)省的丹參分布在不同的類(lèi)群中，表明丹參藥材遺傳變異與地理分布無(wú)明顯相關(guān)性，這說(shuō)明丹參產(chǎn)區(qū)之間的遺傳分化不明顯。

2.4 cpSSR和mtSSR標(biāo)記在鼠尾草屬種間的通用性

利用13對(duì)mtSSR和10對(duì)cpSSR標(biāo)記分別對(duì)丹參、墨西哥鼠尾草(S.leucantha)和康定鼠尾草(S.prattii)等進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果(表5)顯示：11對(duì)mtSSR標(biāo)記和9對(duì)cpSSR標(biāo)記能在3種以上的植物中擴(kuò)增出清晰的條帶。11對(duì)mtSSR引物在9種鼠尾草屬中的平均通用性比率為64.63%，通用性較高；9對(duì)cpSSR引物在10種鼠尾草屬中的平均通用性比率為44.66%，通用性較低。

表4 23對(duì)mtSSR和cpSSR標(biāo)記的遺傳參數(shù)

61份材料編號(hào)同表1圖2 基于遺傳距離的61份丹參資源聚類(lèi)圖 The 61 variety codes were the same as in Table 1Fig.2 Cluster diagram of 61 accessions of S. miltiorrhiza based on genetic distance

2.5 cpSSR標(biāo)記在野芝麻亞科植物屬間的通用性

將10對(duì)cpSSR引物分別在22條基因組序列中用電子PCR進(jìn)行分析，結(jié)果(表6)發(fā)現(xiàn)，引物cp5p、cp8p和cp10p分別在3個(gè)屬4條基因組序列、8個(gè)屬21條基因組序列和6個(gè)屬12條基因組序列生成特異性產(chǎn)物，表明這3對(duì)引物在野芝麻亞科植物屬間的通用性較好。

3 討 論

3.1 61份丹參品種間的親緣關(guān)系

通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，采集的61份丹參的遺傳相似性系數(shù)為0.54～0.96。山東32號(hào)和四川中江49號(hào)，中間材料47號(hào)和四川中江52號(hào)品種，遺傳距離最小，相似性系數(shù)最大。此外，來(lái)源于四川中江、山東和安徽的丹參聚在Ⅰ、Ⅱ亞群，說(shuō)明四川中江、山東和安徽地區(qū)的丹參親緣關(guān)系較近，具有很大的相似性，可能是因?yàn)樗拇ㄖ薪⒌姆N植主要采用根段無(wú)性繁殖方式栽培，在栽培過(guò)程中引來(lái)了外來(lái)種源，不同地區(qū)進(jìn)行種質(zhì)互換、基因交流等引起的。9份中間材料聚在Ⅰ亞群，可能它們母本之間親緣關(guān)系較近；而5號(hào)四川中江小葉丹參品種形成了相對(duì)獨(dú)立的亞群，小葉丹參經(jīng)產(chǎn)地長(zhǎng)期選根留種，形成了具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐旱、畝產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)的穩(wěn)定遺傳因子，且在長(zhǎng)期栽培過(guò)程中和其他產(chǎn)地丹參品種間基因交流較少所致。總體看，四川丹參出現(xiàn)在絕大部分亞群中，說(shuō)明四川丹參仍保留著較為豐富的遺傳多樣性。為保護(hù)四川丹參資源的多樣性，提高四川丹參的質(zhì)量，急需對(duì)四川丹參資源進(jìn)行系統(tǒng)收集評(píng)價(jià)，為生產(chǎn)提供更加優(yōu)質(zhì)的種源。

表5 mtSSR和cpSSR引物在鼠尾草屬種間的擴(kuò)增結(jié)果

注: -. 表示鼠尾草沒(méi)有用mtSSR來(lái)檢測(cè)

Note：-. Indicates thatSalviais not detected with mtSSR

表6 cpSSR引物在野芝麻亞科植物屬間的擴(kuò)增結(jié)果

3.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提，對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)能力越強(qiáng)的物種，其遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富；反之，容易受到環(huán)境變化影響的物種其遺傳多樣性較低[11]。期望雜合度(He)被認(rèn)為是衡量一個(gè)物種遺傳多樣性水平高低的標(biāo)準(zhǔn)，本研究結(jié)果表明丹參的期望雜合度為0.346，高于雙子葉植物的平均水平(He=0.190)，多態(tài)信息含量在0.089～0.373之間，平均值為0.278，Shannon’s指數(shù)平均值為0.519，說(shuō)明所收集的丹參種質(zhì)資源呈中等水平的遺傳多樣性。與王海[9]、宋杰[12]、Hyejin An[13]等研究丹參遺傳多樣性的結(jié)果是一致的。本研究開(kāi)發(fā)的23對(duì)SSR引物在丹參中具有較高的多態(tài)性，說(shuō)明mtSSR和cpSSR引物對(duì)丹參具有良好的鑒別能力，可以作為品種鑒定的一個(gè)輔助工具。

3.3 cpSSR和mtSSR標(biāo)記的通用性

近年，人們對(duì)葫蘆科[14]、虎耳草科[15]、蠟梅科[16]、松科[17]、禾本科[18]、豆科[19]、茄科[20]、菊科[21]、葡萄科[22]及薔薇科[23]等近緣物種間通用性進(jìn)行了大量研究，并且開(kāi)發(fā)了一定數(shù)目通用SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記可以為遺傳學(xué)和基因組學(xué)等方面的研究提供更多的遺傳信息[24]。本研究所選用的11對(duì)mtSSR標(biāo)記在鼠尾草屬通用性比率為64.63%，比宗成堃[25]利用EST-SSR標(biāo)記在唇形科鼠尾草屬通用性分析結(jié)果高，表明丹參mtSSR在鼠尾草屬中有較好的通用性。而9對(duì)cpSSR在唇形科鼠尾草屬通用性比率為44.66%，低于宗成堃的研究結(jié)果。顯然，mtSSR和cpSSR引物在鼠尾草屬內(nèi)較高的可轉(zhuǎn)移性極大地減輕了引物開(kāi)發(fā)的工作量，同時(shí)為研究種間進(jìn)化關(guān)系提供了一條有效途徑。