劉東讓，侯喜林，張昌偉，肖 棟,*

(1 中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 農業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081；2 南京農業(yè)大學 作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095；3 江蘇現(xiàn)代園藝工程技術中心，南京 210095)

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一種富含半胱氨酸短肽的低分子量蛋白，普遍大小為5～10×103Da[1]。1957年，金屬硫蛋白在馬腎皮質中被發(fā)現(xiàn)，植物MT最早是于1977年從大豆根中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MT廣泛分布于動物、植物、真菌及細菌等幾乎所有生物體內[2-6]。Fowler等[7]根據(jù)MT中Cys殘基的排列方式，將所有生物的MT分為3類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類)。

植物中，根據(jù)半胱氨酸殘基數(shù)目和排列的不同可將MT歸為Ⅱ類[8-9]。根據(jù)Cobbett等[10]的分類，可將植物Ⅱ類MT進一步分為4種類型：MT1(p1)、MT2(p2)、MT3(p3)與MT4(pec/Ec蛋白)。已有研究表明，植物MT2包含2個富含半胱氨酸的結構域，每個域包含1個高度保守的MSCCGGNCGCG結構以及3個Cys-Xaa-Cys模塊，被大約40個的氨基酸殘基連接，多分布在地上部分[11]。據(jù)報道，MT與植物的生長發(fā)育、胚發(fā)育、果實成熟、衰老、抗逆反應以及基因調控等過程有關[12]。目前多數(shù)研究認為，MT的主要功能是與生物體內的金屬離子相結合，從而起到運輸、儲存金屬離子、維持細胞內的氧化-還原平衡等作用，而且生物體內的MT大多需經(jīng)過金屬離子、細胞分裂素、鹽、干旱等脅迫誘導才會表達[13]。植物激素脫落酸(ABA)作為重要的內源信號物質，在誘導植物抗病反應中發(fā)揮了重要作用[14]。因此，克隆MT基因并分析該基因的表達特征，對探討不結球白菜對逆境的響應機理及抗逆分子育種具有重要價值。人們已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、甘藍型油菜(BrassicanapusL.)、芹菜(ApiumgraveolensL.)、平邑甜茶(Malushupehensis)等植物中克隆了編碼MT蛋白的基因或cDNA 序列[1,12,15-17]。但與對動物MT的研究相比，對植物MT的研究遠遠不足[18]。近年來，對植物MT基因在組織器官特異性、表達特征和基因組結構等方面的研究得到一定發(fā)展[4]。盡管已從植物中克隆到許多編碼MT的基因，但對不結球白菜MT基因的研究報道很少。

不結球白菜(Brassicacampestris ssp.chinensis)是中國重要的綠葉蔬菜，由于世界范圍內的廣泛引種，不結球白菜逐漸成為世界性蔬菜[19]。各類病害、外源ABA、鹽、干旱等生物和非生物脅迫常影響不結球白菜生長發(fā)育，導致其產(chǎn)量下降，品質降低[14,20]。因此，本研究以cDNA-AFLP方法從不結球白菜中獲得的受霜霉病菌誘導的差異表達片段為基礎[21]，利用RACE技術從不結球白菜抗病系‘蘇州青’中克隆了BcMT2基因，并進行了氨基酸序列分析。同時通過qRT-PCR技術分析BcMT2基因在不同組織、生物脅迫(霜霉病菌)及非生物脅迫(鹽、干旱、ABA)處理條件下的表達模式，并通過原核表達對該基因的蛋白特征進行鑒定。旨在深入研究MT基因在不結球白菜上的表達模式，進而為選育高產(chǎn)、優(yōu)質的新品種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試材料為南京農業(yè)大學園藝學院白菜課題組提供的不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病品種‘蘇州青’和感病品種‘矮腳黃’。所有的種子先在1.0 g·L-1HgCl2里消毒20 min，再用蒸餾水沖洗10次。后將2個品種的種子分別播種于2個72孔穴盤的滅菌基質中，后放置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每日22 ℃光照培養(yǎng)16 h，16 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對濕度(85%±5%)。待催芽28 d(5～6片真葉)后，分別從2個品種中選出63株長勢良好的植株用于誘導處理。

1.2 實驗方法

1.2.1生物、非生物脅迫處理及取樣從感病的不結球白菜上分離霜霉病菌(P.parasitica)，配成1×105mL-1孢子囊懸浮液，霜霉病病原菌接種液的制備參照陳曉峰[22]的方法。播種28 d后，分別用霜霉病接菌液、200 g·L-1PEG6000、400 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA及純水對選出的植株進行處理，取樣時間點有5個，每個時間點3個重復，即每個品種每個脅迫處理15株植株，純水處理需3個重復，總計每個品種需63株樣本。處理后在人工氣候箱20 ℃黑暗中保濕24 h，然后揭掉遮光物，再在22 ℃光照培養(yǎng)16 h，16 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對濕度(85%±5%)條件下培養(yǎng)，直至采樣結束。組織特異性表達分析使用的材料分別取自2份未經(jīng)脅迫處理的不結球白菜植株苗期(播種后28 d)的根、莖、葉。脅迫處理表達分析，分別在處理后12、24、48、72和96 h進行取樣。上述材料取樣后立即在液氮中冰凍，使用前保存在-70 ℃冰箱中。

1.2.2RNA提取和cDNA合成使用RNA Simple Total RNA Kit試劑盒(TaKaRa)提取樣品總RNA，具體方法參照說明書。用核酸儀對提取的總RNA濃度和純度進行檢測。cDNA使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)反轉錄合成，作為基因克隆所需的模板。

1.2.3BcMT2全長cDNA克隆以霜霉病菌誘導后24 h的不結球白菜‘蘇州青’葉片為試材，使用3′/5′RACE System 試劑盒(Invitrogen)克隆基因全長cDNA序列。具體操作過程參考陳曉峰[22]的方法。克隆BcMT2基因的引物見表1，引物設計用在線軟件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，引物由南京擎科公司合成。

1.2.4序列分析用Bioxm 2.7軟件分析BcMT2基因序列的開放閱讀框(open reading frame, ORF)。

表1 本研究用到的各種引物信息

注：F.正向引物；R.反向引物；UP.上游引物；Down.下游引物；下劃線為SacⅠ和BamH Ⅰ酶切位點序列；酶切位點之前堿基為保護堿基。

Note: F. Forward; R. Reverse; UP. Upstream primer; Down. Downstream primer; Underlined. Sequence ofSacⅠ andBamHⅠ. The front of the restriction site is protective bases

不同物種BcMT2基因的氨基酸序列從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中搜索獲得；同源性計算利用 NCBI網(wǎng)站Blast程序；氨基酸編碼的蛋白質相對分子質量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)等通過在線軟件Protparam(https://web. expasy.org/Protparam/)完成；疏水性預測采用protscale(https: //web. expasy.org/protscale/)；信號肽預測采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜區(qū)域預測采用TMHMM 2.0(http:// www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；蛋白質結構域分析采用NCBI-Conserved Domain SearchInterpro；蛋白質二級結構預測采用Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/ NPSA/npsa_phd/)等在線工具；多重序列比對及進化樹構建通過DNAMAN 5.2進行[23]。

1.2.5實時定量分析BcMT2轉錄表達水平cDNA合成使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)說明書完成。實時定量PCR使用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Ⅱ試劑盒(TaKaRa, Japan)完成，PCR反應體系采用20 μL體系：MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，rTaq酶0.2 μL，引物BcSGT1_RT_F和BcSGT1_RT_R各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補齊至20 μL。PCR程序采用兩步法：95 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；設置60 ℃到95 ℃的熔解曲線。3次重復，用純水作為對照。試驗數(shù)據(jù)采用ΔΔCT方法[24]和Excel 2010軟件進行分析，差異顯著性分析采用SPSS19.0軟件進行。

1.2.6原核表達將克隆的BcMT2基因連接至pMD19-T載體，再轉化DH5α感受態(tài)細胞，獲得重組質粒pMD19-T-BcMT2。用SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切及菌液PCR鑒定后，含陽性重組質粒的菌液送交南京擎科公司測序。把上述測序正確的重組質粒作為模板，以上游引物BcMT2_Up和下游引物BcMT2_Down擴增BcMT2基因編碼區(qū)(表1)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后用限制性內切酶SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，構建重組表達質粒pET29a-BcMT2，轉化大腸桿菌BL21(DE3)。挑取陽性菌落接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含200 μg·mL-1氨芐青霉素)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，以此作為種子液。取種子液用終濃度為0.6和1.0 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導EscherichiacoliBL21 (DE3) 表達融合蛋白，設置取樣時間分別為2、4、6 h。取菌液3 mL，12 000 r·min-1離心30 s，棄上清液，用100 μL的1×SDS-PAGE加樣緩沖液重懸菌體，將上清液參照Tashakkori等[25]的方法進行SDS-PAGE分析。

2 結果與分析

2.1 BcMT5基因cDNA全長克隆以及序列分析

以cDNA-AFLP方法從不結球白菜中獲得的霜霉病菌誘導的差異表達片段(397 bp)為基礎，采用RACE技術獲得其全長，命名為BcMT2(登錄號為AB439836)。該基因cDNA序列全長為528 bp，含有243 bp的完整開放閱讀框，編碼80個氨基酸(圖1)。預測其編碼蛋白質化學式為C319H497N91O117S17，分子質量為8.02×103Da，理論等電點為4.61。屬于酸性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為43.29，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為22.00。ProtScale親/疏水性預測顯示：該蛋白屬于親水性蛋白，總平均親水指數(shù)(GRAVY)為-0.245；該蛋白無信號肽，并且不存在跨膜區(qū)域；該蛋白在第23～239個氨基酸處有一個Metallothio-2結構域。屬于植物MT2家族，又與擬南芥中的多種金屬硫蛋白序列進行比對，BcMT2也屬于植物MT2(圖2)。蛋白二級結構預測結果顯示:其為延伸鏈和無規(guī)則卷曲，分別占17.5%和82.5%。該基因在起始密碼子ATG之前有A，符合Kozak規(guī)律；在3′端有poly(A)尾，這些都符合有效翻譯的基因全長cDNA的特征。

方框表示起始密碼子，下劃線表示Metallothio-2 結構域，*表示終止密碼子圖1 BcMT2核苷酸序列(上)及其 翻譯的氨基酸序列(下) Square frame indicates the translation initiation codon, underline indicates the amino acid sequence of the Metallothio-2, an asterisk (*) indicates the stop codonFig.1 The nucleotide (upper row) and amino acid sequence (lower row) of BcMT2

2.2 BcMT2蛋白氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進化分析

將BcMT2編碼的氨基酸序列及從NCBI中BLAST獲取的其他植物MT2氨基酸序列(編碼區(qū))進行系統(tǒng)樹分析。結果(圖3)顯示，不結球白菜BcMT2與大白菜第5號染色體的基因(Bra029765)的相似性為100%；與蘿卜、擬南芥和甘藍相似性分別為97%、96%和95%；與高山南芥和甘藍型油菜相似性在85%以上。表明同科植物的氨基酸序列相似度較高。由此發(fā)現(xiàn)十字花科植物的BcMT2蛋白與同屬植物的進化關系最近，呈現(xiàn)種屬特性。

2.3 BcMT2基因的組織特異性表達分析

結果(圖4)表明，BcMT2基因在兩份材料的葉中表達最強，且表達量遠高于根和莖。另外，BcMT2基因在兩份材料莖中的表達量存在顯著差異(P< 0.05)，且在‘蘇州青’莖中的表達量約為在‘矮腳黃’中的5.93倍，而在根和葉中表達量差異不顯著。

圖2 BcMT2和擬南芥中金屬硫蛋白 氨基酸序列的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of BcMT2 and metallothioneins of Arabidopsis thaliana

圖3 不同植物BcMT2蛋白的系統(tǒng)樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of BcMT2 proteins from different plants

2.4 生物及非生物脅迫下BcMT2的表達分析

由圖5可見，霜霉病菌侵染處理下，BcMT2基因在抗病品種‘蘇州青’中的表達量于48 h達到峰值(為對照的6.01倍)，而在感病品種‘矮腳黃’中的表達量于72 h達到峰值(為對照的5.6倍)；在鹽處理下，BcMT2基因在抗病品種‘蘇州青’中的表達量于12 h達到峰值(為對照的2.51倍)，而在感病品種‘矮腳黃’中的表達量于24 h達到峰值(為對照的2.22倍)；在ABA處理下，‘蘇州青’中其表達量于24 h達到峰值(為對照的17.25倍)，且在‘矮腳黃’中BcMT2基因的表達趨勢與‘蘇州青’類似；而在2個材料中，干旱處理均抑制了BcMT2基因的表達。t測驗表明在4個處理過程中，在部分時間點上抗病系‘蘇州青’與感病系‘矮腳黃’之間表達量存在顯著差異。表明BcMT2基因在不結球白菜受生物和非生物脅迫的干擾后參與了防衛(wèi)反應，而且在抗病系植株上比感病系植株上表達更早、表達量更強。

2.5 BcMT2基因的原核表達分析

對BcMT2進行原核表達分析，發(fā)現(xiàn)在37 ℃條件下，0.6 mmol·L-1IPTG誘導2、4、6 h后，均沒有融合蛋白表達。而1.0 mmol·L-1IPTG誘導2、4、6 h后，在底部出現(xiàn)明顯的表達特異條帶(圖6)。BcMT2在E.coliBL21(DE3)中獲得了表達，表達蛋白的相對分子質量約為8×103Da。

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著性圖4 不同不結球白菜BcMT2基因的組織 特異性表達分析 Different normal letters mean significant differeace at 0.05 levelFig.4 Tissue specificity expression profiles of BcMT2 gene in different non-heading cabbages

不同小寫字母表示0.05水平差異顯著性；不同大寫字母表示0.01水平差異顯著性圖5 ‘蘇州青’和‘矮腳黃’脅迫誘導后BcMT2基因的表達 Different normal letters mean significant difference at 0.05 level; different capital letters mean significant difference at 0.01 levelFig.5 Expression of BcMT2 in ‘Suzhouqing’and ‘Aijiaohuang’under stress

M. Marker圖6 BcMT2基因原核表達SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis of the prokaryotic expression of BcMT2 gene

3 討 論

據(jù)報道，植物MT基因家族成員的多肽長度為45～87個氨基酸殘基，Cys殘基含量在10～17個，而His殘基含量很低[4]。本研究在通過cDNA-AFLP技術得到的一個差異表達片段基礎上，利用RACE技術克隆了BcMT2基因的全長序列。通過核苷酸和氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)BcMT2基因編碼80個氨基酸，其中含有14個Cys殘基，占總氨基酸數(shù)的17.5%。這與王順才等[16]在平邑甜茶中的研究結果一致。植物MT2多肽N端通常具有高度的保守序列MSCCGGNCGCGS，Cys殘基有典型的CC、CXC和CXXC排列方式，而且C端包含3個按CXC方式排列的Cys基序[10]。本研究發(fā)現(xiàn)BcMT2基因編碼蛋白含有與之相同的保守序列MSCCGGNCGCGS，同時N端包含1個CC、1個CXXC及2個CXC基序，在C端也有3個CXC基序。這與水稻、平邑甜茶、芹菜等植物的研究結果相一致[1,16,26]。進一步，將BcMT2基因氨基酸序列與擬南芥MT氨基酸序列進行比對，構建進化樹，發(fā)現(xiàn)與擬南芥MT2的進化關系最近。此外，多重序列比對分析表明，BcMT2基因氨基酸序列與同科的大白菜、蘿卜、擬南芥等植物具有很高的同源性，其中與大白菜第5號染色體的基因(Bra029765)一致性最高(100%)。綜合這些結果，不結球白菜BcMT2基因屬于Ⅱ類植物MT2基因家族。

目前普遍認為，植物MT基因的表達具有明顯的組織特異性。已有研究發(fā)現(xiàn)，MT2在地上部的表達明顯高于根[1]。擬南芥AtMT1在根中表達豐富，在葉中的表達量低；AtMT2在葉中的表達量比根中的高；AtMT3主要在果實和葉中表達；AtMT4主要在種子中表達[4,18,27]。本研究也發(fā)現(xiàn)，BcMT2基因在不結球白菜地上部(莖、葉)中的表達量明顯高于根，且葉中的表達量明顯高于其他部位，這與齊世靜等[28]的研究結果一致。

適宜的環(huán)境有利于白菜的生長發(fā)育，而異常的環(huán)境則會抑制白菜的生長發(fā)育，甚至導致死亡。霜霉病、干旱、鹽及外源激素等外界生物和非生物脅迫會嚴重影響白菜的品質和產(chǎn)量。為了適應這些逆境，植物進化出了一套復雜的抵御系統(tǒng)[9]。金屬硫蛋白基因在金屬解毒方面可以發(fā)揮很大的作用[1,18]。目前在MT基因表達影響因素方面，金屬離子研究已有很多。除此之外，MT基因表達還受環(huán)境脅迫、激素、病菌侵染等因素的調節(jié)[4,21,29]。Xiao等[21]通過cDNA-AFLP發(fā)現(xiàn)MT2基因在霜霉菌誘導下于48 h后表達量達到峰值。這與本實驗BcMT2在‘蘇州青’中的表達趨勢一致，同時發(fā)現(xiàn)不論在抗病系‘蘇州青’還是感病系‘矮腳黃’上BcMT2均受到霜霉病菌的誘導，且在抗病系比在感病系表達量更早、更強。說明BcMT2的誘導與基因型的抗病或感病能力有一定的聯(lián)系。已有多項研究在不同植物上表明，鹽和外源ABA處理會誘導MT基因的表達[1,16,27,29]。這與本研究結果一致，且發(fā)現(xiàn)BcMT2基因在不結球白菜抗病系‘蘇州青’和感病系‘矮腳黃’上的表達量出現(xiàn)了不同時間的誘導高峰。表明BcMT2涉及的防衛(wèi)反應可能是在不同時間段，通過產(chǎn)生不同的信號途徑對外源脅迫發(fā)揮作用。另有研究顯示，干旱脅迫下MT基因的表達大幅度上升[30]。而陳逸云[1]則在芹菜品種‘六合黃心芹’中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會抑制MT2基因的表達。本研究結果與陳逸云[1]類似，在干旱脅迫下，BcMT2基因在2個不結球白菜品種中的表達均受到了抑制。

BcMT2原核表達分析發(fā)現(xiàn)，分別在37 ℃、1.0 mmol·L-1IPTG誘導2、4、6 h后，檢測到了一條蛋白分子質量約為8×103Da的表達特異條帶，其與預期融合蛋白的相對分子質量的理論值8.02×103Da相符。而含有轉化子但未經(jīng)誘導的菌體在該蛋白條帶處未出現(xiàn)此條帶，因此可以基本確定這一蛋白條帶為表達的融合蛋白。

綜上所述，不結球白菜BcMT2基因屬于Ⅱ類植物MT2基因家族，受霜霉病菌、鹽、外源激素ABA等外界生物和非生物脅迫誘導表達，表明不結球白菜BcMT2基因在處于生物脅迫和非生物脅迫等逆境環(huán)境中均發(fā)揮著重要作用，且BcMT2在大腸桿菌中成功實現(xiàn)融合表達，這為下一步蛋白水平研究和轉基因功能研究提供了條件，也將為選育高產(chǎn)、優(yōu)質的不結球白菜新品種提供重要的理論依據(jù)。