馬得森，王聯(lián)星，史國民，何 濤

(青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海省園林植物與觀賞園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

花青素(Anthocyanins)屬于類黃酮物質(zhì)，是一種水溶性天然色素，可以使植物呈現(xiàn)多種顏色[1]。它廣泛存在于植物中，最常見的有6類，分別是飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、錦葵色素、芍藥色素和牽?；ㄉ豙2]。隨著對花青素不斷深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)其擁有抗氧化[3]、改善肝功能[4]、降血糖[5]、抗癌[6]、抗炎[7]、防輻射[8]和保護(hù)視力[9]等多種生理作用。因此，花青素被廣泛應(yīng)用到食品、保健品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，有著很好的前景。

TTG1 (TRANSPARENTTESTAGLABRA1)基因編碼的蛋白一般含有WD40重復(fù)基序，所以被稱為WD40蛋白，該調(diào)控因子與花青素的合成[10]、根毛發(fā)育[11]、表皮毛發(fā)育[12]和種子休眠[13]等密切相關(guān)。目前，已先后從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[14]、棉花(Gossypiumhirsutum)[15]、油菜(Brassicanapus)[16]、紫羅蘭(Matthiolaincana)[17]、茄子(Solanummelongena)[18]等多種植物中克隆出該基因。其中，有學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)擬南芥ttg1-13突變體表現(xiàn)出無花青素的特性。Humphries等[15]克隆出了棉花GhTTG1基因并發(fā)現(xiàn)該基因能夠彌補(bǔ)擬南芥ttg1突變體中無花青素的缺陷。Lu等[16]發(fā)現(xiàn)油菜的BnTTG1在各個組織器官中都有表達(dá)，跟擬南芥AtTTG1基因的組織表達(dá)模式相同，推測其可能在油菜種皮色素的形成中有重要的調(diào)控作用。在紫羅蘭TTG1蛋白氨基酸鏈中的一個色氨酸突變?yōu)榫彼?，?dǎo)致DFR(Dihydroflavonol-4-Reductase)不表達(dá)，花青素合成受阻，所開的花為白花[17]。劉新宇等[18]發(fā)現(xiàn)在茄子中SmTTG1參與花青素的合成。

黑果枸杞的果實(shí)中含有豐富的花青素，是藍(lán)莓的18倍之多。但是黑果枸杞LrTTG1基因與花青素的關(guān)系還不是很清楚，為此，本研究以黑果枸杞為材料，采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，分離黑果枸杞TTG1基因，探討了該基因在不同組織及紫外脅迫下的表達(dá)特性，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)種子和組織采自柴達(dá)木盆地東沿都蘭縣境內(nèi)的諾木洪農(nóng)場，其中青果為開花后15 d、紫果為開花后22 d、黑果為開花后30 d。

選取培養(yǎng)60 d的種子苗，按照師生波等[19]的方法進(jìn)行紫外脅迫處理，分別于處理后1、3、6、9和12 h取葉片為材料。

1.2 方 法

1.2.1黑果枸杞LrTTG1基因的克隆根據(jù) NCBI上已克隆到的其他植物TTG1序列設(shè)計(jì)簡并引物Primer-F1(5′-ATGGA(A/T/G)AATTCAA-GTCAAGAATC-3′)、Primer-R1(5′-TTATACTTTAAGCAGCTGCAACTTG-3′)。取黑果枸杞葉片，按照MiniBest Universal RNA Extraction Kit操作流程，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以Primer-F1/R1為引物，使用EXTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增獲得LrTTG1基因的中間保守序列，將克隆獲得的序列連接至pMD?19-T載體上進(jìn)行測序。根據(jù)已得到的中間序列設(shè)計(jì)3-RACE的外側(cè)引物3′-GPS-1(5′-GACGATTATTTATGAGTCCCCACAA-3′)、內(nèi)側(cè)引物3′-GPS-2(5-ATGGGATTGATCCTATGTCGATGTA-3′)和5′-RACE的外側(cè)引物5′-GPS-1(5′-GAGTTTAGTAGGTGGATAAGGGTG-3′)、內(nèi)側(cè)引物5′-GPS-2(5′-GGCGGTTATTGAGTGAAG-GG-3′)。按照TaKaRa公司的SMARTer?RACE 5′-/3′-Kit說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD?19-T載體上進(jìn)行測序。根據(jù)3個片段拼接成的LrTTG1基因cDNA序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)rTTG1F (5′-CACTTCCATTTTCCCCTCA-3′)、LrTTG1R (5′-CACCTTCAAGCAGTCCAAAA-3′)進(jìn)行Confirm PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD?19-T載體上進(jìn)行測序。

1.2.2黑果枸杞LrTTG1基因的生物信息學(xué)分析通過ORF Finder尋找開放閱讀框；使用DNAMAN 6.0和NCBI上的Blast進(jìn)行同源比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)并利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；采用SOPMA(http://pbil.ibcp.fr)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)對氨基酸的二、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用在線軟件NCBI CDD預(yù)測LrTTG1蛋白的保守域；通過PSORT(http://psort.nibb.ac.jp)在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.3花青素含量檢測花青素提取和測定參考邵文婷等的pH示差法[20]。

1.2.4LrTTG1基因的表達(dá)分析以黑果枸杞莖、葉、花、青果、紫果、黑果和紫外處理不同時間下的葉片cDNA為模板，內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin，內(nèi)參引物為β-Actin-F(5′-TATTTCAAGGTCAAGATACCT-3)、β-Actin-R (5′-GAGTCAATCCCATTAGGCCC-3′)，LrTTG1實(shí)時熒光定量引物為Rt-TTG1-F (5′-CCCACAACCTGATACTCCGT-3′)和Rt-TTG1-R(5′-TGCAACAGTAGGCAACTCCC-3′)。按照SYBR Premix ExTaqⅡ說明書進(jìn)行qRT-PCR，PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，38個循環(huán)，95 ℃ 10 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞LrTTG1基因的克隆

如圖1所示，獲得保守片段約1 000 bp(圖1)，3′-RACE片段約500 bp(圖1)，5′-RACE片段約100 bp(圖1)，gDNA片段約1 000 bp(圖1),將中間片段、3′-端和5′-端目的片段進(jìn)行拼接，在開放閱讀框區(qū)域外設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行Confirm擴(kuò)增驗(yàn)證，得到預(yù)期的片段(圖1)，最終得到1條全長為1 453 bp的完整黑果枸杞LrTTG1基因的cDNA序列。它包含1 029 bp的開放閱讀框、71 bp的5′-UTR和353 bp的3′-UTR，其中包括17 bp的polyA。將其命名為LrTTG1，GenBank登錄號為MH633481。黑果枸杞LrTTG1基因組DNA序列與cDNA序列比對結(jié)果表明，該基因序列中不包含內(nèi)含子。

2.2 黑果枸杞LrTTG1基因的生物信息學(xué)分析

通過ORF Finder發(fā)現(xiàn)LrTTG1的長度為1 029

bp，編碼342個氨基酸(圖2)，理論分子量為38.302 1 kDa，等電點(diǎn)為4.95；將LrTTG1推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物TTG1轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)LrTTG1與茄子SmTTG1(KP006501.1)進(jìn)化距離最近，相似性高達(dá)83.73%，與黃瓜、馬鈴薯等茄科植物均有較高的序列相似度。與云杉PaTTG1(KU131225.1)的進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn)，相似性為58.4%。通過DNAman6.0比對不同植物的TTG1氨基酸序列如圖4所示，多重對比顯示它們的氨基酸相似性比較高。SOPM軟件分析結(jié)果顯示，LrTTG1蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋(alpha helix)結(jié)構(gòu)占9.36%，β轉(zhuǎn)角(beta turn)結(jié)構(gòu)占4.09%，無規(guī)則卷曲(random coil)結(jié)構(gòu)占51.75%，延伸帶(extended strand)結(jié)構(gòu)占34.80%(圖5，A)。LrTTG1蛋白三級結(jié)構(gòu)如圖5，B。利用在線軟件NCBI CDD預(yù)測LrTTG1蛋白的保守域，結(jié)果表明LrTTG1屬于WD40超家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，LrTTG1蛋白定位于細(xì)胞核的可能性為69.6%，符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位特征。

*.終止密碼子；陰影部分為TTG1蛋白的5個保守功能域圖2 黑果枸杞LrTTG1cDNA全長及其編碼序列 *.Termination codon; The shaded regions are 5 conservative functional domains of TTG1 proteinFig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LrTTG1

M. DL2000; 1. 保守片段Conserved region; 2. 3′-RACE; 3. 5′-RACE; 4. Confirm; 5. gDNA圖1 黑果枸杞LrTTG1基因的克隆Fig.1 Amplification of LrTTG1 gene in Lycium ruthenicum

圖3 TTG1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of TTG1

SmTTG1. 茄子(KP006501.1)；StTTG1. 馬鈴薯(JX848661.1)；CsTTG1. 黃瓜(NM001280758.1)；LrTTG1. 黑果枸杞圖4 TTG1蛋白多序列比對 SmTTG1.Solanum melongena；StTTG1.Solanum tuberosum；CsTTG1.Cucumis sativus；LrTTG1.L. ruthenicumFig.4 Multiple sequence alignment result of TTG1

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著,下同圖6 不同組織花青素含量 Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level; the same as blowFig.6 Anthocyanin content in different tissues

圖7 不同組織LrTTG1基因表達(dá)水平Fig.7 Analysis on expression of LrTTG1 gene in different tissues

2.3 不同組織中黑果枸杞LrTTG1基因表達(dá)水平及花青素含量檢測

檢測不同組織中的花青素含量，發(fā)現(xiàn)黑果中的花青素含量最高(11.3 mg/g)，顯著高于其他組織；葉中的花青素含量最低為0.1 mg/g(圖6)；從不同成熟度果實(shí)花青素的含量來看，越成熟的果實(shí)中其花青素含量越高。

檢測不同組織中的LrTTG1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LrTTG1基因在檢測組織中均有表達(dá)，且青果中表達(dá)量最高，約為黑果中的4倍，而黑果中的表達(dá)量最低(圖7)。這表明LrTTG1基因存在組織表達(dá)特異性且在果實(shí)發(fā)育的前期(0～15 d)發(fā)揮重要作用。

2.4 黑果枸杞LrTTG1基因受紫外脅迫后的表達(dá)水平分析

如圖8所示，隨著紫外脅迫時間的延長，在黑果枸杞種苗葉片中LrTTG1基因的表達(dá)趨勢呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，在1 和3 h顯著降低分別是對照組的0.94和0.96倍，在6 h表達(dá)量最低約是對照組的0.93倍；9 h后開始恢復(fù)到對照組基因表達(dá)水平。綜合來看，黑果枸杞LrTTG1基因能夠響應(yīng)紫外輻射。

圖8 LrTTG1基因在紫外脅迫下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of LrTTG1 gene under UV irradiation

3 討 論

本研究從黑果枸杞中克隆得到LrTTG1基因，序列分析表明，LrTTG1基因編碼的蛋白屬WD40型轉(zhuǎn)錄因子。WD40型轉(zhuǎn)錄因子已被證明廣泛參與調(diào)控植物花青素的生物合成。在玉米(Zeamays)中，其中1個WD40型轉(zhuǎn)錄因子基因pac1缺失可導(dǎo)致a1、bz1和c2這些花色素苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)下調(diào)，在種子的糊粉層沒有花青素的積累，但是種皮的花青素合成并不受到影響，而ttg1能充分互補(bǔ)pac1功能[21-22]。在擬南界芥ttg1突變體中花青素的合成受到影響，說明TTG1蛋白參與花青素合成調(diào)控過程[10]。劉凱歌等[23]發(fā)現(xiàn)在突變體ttg1-13背景下，異源表達(dá)甘藍(lán)型油菜BnTTG1-1基因能夠完全恢復(fù)該突變體不能合成花青素的缺陷。同源性分析表明，LrTTG1蛋白與茄子SmTTG1蛋白在同一分支上，進(jìn)化關(guān)系最近。茄子SmTTG1基因被證實(shí)參與調(diào)控花青素的合成[18]，推測黑果枸杞LrTTG1基因可能具有類似的生物功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著黑果枸杞果實(shí)的發(fā)育，LrTTG1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢，而花青素的含量則呈上升趨勢，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Takada等[24]在煙草中過表達(dá)甜瓜乙烯受體的突變基因(Cm-ETRI/H69A)，結(jié)果使得花瓣中的花青素含量增加，從而證明乙烯負(fù)調(diào)控花青素相關(guān)基因的表達(dá)。高樹林等[25]發(fā)現(xiàn)乙烯處理對花青素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)有抑制作用。推測LrTTG1基因在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)量下降可能與乙烯相關(guān)，成熟果實(shí)中的乙烯含量往往更高，它們抑制了LrTTG1基因的表達(dá)。為了研究LrTTG1基因與紫外輻射之間的關(guān)系，對黑果枸杞種苗進(jìn)行了紫外脅迫處理，LrTTG1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在1、3和6 h的表達(dá)量與對照組相比存在顯著性差異。姚攀鋒[26]對苦蕎進(jìn)行了紫外脅迫，發(fā)現(xiàn)FtWD40基因響應(yīng)紫外脅迫，表明FtWD40可能參與了花青素的合成。強(qiáng)維亞等[27]對高山植物歪頭菜(ViciaunijugaA.Br.)進(jìn)行了紫外照射，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源激素先升高后下降。Ma等[28]發(fā)現(xiàn)不同的環(huán)境因素或激素對花青素合成相關(guān)基因有促進(jìn)或抑制的作用。以上研究說明花青素合成相關(guān)基因能響應(yīng)紫外脅迫，紫外脅迫可改變植物體內(nèi)激素含量，從而抑制花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，這可能是黑果枸杞LrTTG1基因在紫外脅迫下表達(dá)量下降的原因之一。

本研究克隆了黑果枸杞LrTTG1基因，并對該基因在不同組織中以及紫外處理后的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，推測出LrTTG1基因在黑果枸杞花青素代謝的調(diào)控中起一定作用。后續(xù)將繼續(xù)研究該基因與其他花青素生物合成途徑相關(guān)關(guān)鍵酶基因及激素的關(guān)系，進(jìn)而全面解析其參與黑果枸杞花青素代謝調(diào)控的分子機(jī)制。