任 燕，高 童，陳江飛，楊建坤，黃慧宇，王偉東*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 宜賓學(xué)院 川茶學(xué)院，四川宜賓 644000)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常遭受各種環(huán)境脅迫的影響，與之進(jìn)化形成的脅迫應(yīng)答機(jī)制是其產(chǎn)生適應(yīng)性和抗逆性的關(guān)鍵。其中，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA prorein)作為一類(lèi)高親水性蛋白在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LEA蛋白最早在棉花子葉中被發(fā)現(xiàn)，因其在種子胚胎發(fā)育后期大量積累而得名[1]，之后大量LEA蛋白及其編碼基因在大麥、小麥、水稻、玉米、葡萄、大豆等高等植物中被鑒定[2]，并根據(jù)Pfam結(jié)構(gòu)域類(lèi)型將植物中LEA蛋白分為L(zhǎng)EA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、LEA_6、Dehydrin和SMP(Seed Maturation Protein)8個(gè)亞家族[3]。同時(shí)，越來(lái)越多的研究證實(shí)LEA蛋白除種子外在根、莖、葉、花粉管等組織器官中亦廣泛存在[4]，且它們大多受干旱、極端溫度、高滲透、高鹽、ABA、紫外輻射等環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)，在植物響應(yīng)各種環(huán)境脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。例如，過(guò)表達(dá)大麥HVA1基因(屬于LEA_3亞家族蛋白基因)能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因小麥和水稻對(duì)干旱脅迫耐受性[7]；同樣地，過(guò)表達(dá)柑橘LEA蛋白編碼基因CuCOR19，亦使轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性顯著增加[8]。最近，Saha等[9]研究表明過(guò)表達(dá)擬南芥AtLEA4-1，可以顯著增加轉(zhuǎn)基因芥菜對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性；Liu等[10-11]則證實(shí)玉米ZmLEA5和ZmLEA3的表達(dá)，均可有效提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性；另外，谷子SiLEA14、花生AdLEA5、西瓜ClLEA3-1、多毛番茄ShDHN及苔蘚PpLEA3，相繼被證實(shí)在提高植物體對(duì)不同非生物脅迫耐受性過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-16]。目前，LEA蛋白在逆境脅迫下的生物學(xué)功能及分子調(diào)控機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注。

茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.)O. Kuntze]作為一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)具有較廣泛的栽培種植。然而，茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭遇各種環(huán)境脅迫，其中低溫和干旱脅迫是影響茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因子，嚴(yán)重制約著茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[17]。最近，Muoki等[18]發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)中一個(gè)LEA3類(lèi)似蛋白在環(huán)境脅迫下被上調(diào)表達(dá)；Paul等[19]則發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)CsLEA7所編碼蛋白作為分子伴侶增加了大腸桿菌對(duì)不利環(huán)境的耐受性；而李葉云等[20]的研究表明，茶樹(shù)脫水素基因(CsDHN)可能在防御非生物逆境脅迫和參與種子成熟脫水的活力保護(hù)過(guò)程起一定作用。類(lèi)似的研究發(fā)現(xiàn)[21]，茶樹(shù)干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組分析中一個(gè)LEA基因(基因ID為Unigene47064_All，CsLEA5)被顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)其可能在茶樹(shù)脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究以茶樹(shù)‘龍井長(zhǎng)葉’為材料，克隆獲得了CsLEA5基因的cDNA全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)初步分析了該基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了CsLEA5基因在不同組織及低溫、干旱脅迫下的表達(dá)模式，以期為探討該基因逆境脅迫下的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為茶樹(shù)抗逆分子遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

試驗(yàn)所用材料茶樹(shù)‘龍井長(zhǎng)葉’(C.sinensiscv. ‘Longjingchangye’)為長(zhǎng)勢(shì)一致的2年生扦插穴盤(pán)苗，其在人工氣候培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件為：晝夜溫度28 ℃/22 ℃，光周期12 h/12 h，光照強(qiáng)度240 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度70%～80%。經(jīng)1個(gè)月預(yù)培養(yǎng)后，將茶苗隨機(jī)分成2組，一組在4 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理，另一組將茶苗連同穴盤(pán)一起放置于含20% PEG 6000溶液的周轉(zhuǎn)箱中，使根系完全被浸泡其中以模擬干旱脅迫，其它培養(yǎng)條件不他，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。分別于0、1、2、3、4、8、12、24和48 h取芽下第二葉0.1 g，液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取未處理‘龍井長(zhǎng)葉’茶苗的根、嫩莖、嫩葉和初開(kāi)的花朵各0.1 g，置于液氮中速凍，-80 ℃保存，用于基因的組織特異性表達(dá)分析。

1.2 方 法

1.2.1茶樹(shù)總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用CTAB法提取茶樹(shù)葉片和其他組織材料的總RNA[22]，利用NanoDrop 2000c(Thermo，美國(guó))檢測(cè)RNA濃度與質(zhì)量，并用1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用5×All-In-One RT MasterMix試劑盒(ABM，加拿大)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，用于基因克隆與熒光定量PCR分析。

1.2.2CsLEA5基因全長(zhǎng)cDNA的克隆根據(jù)茶樹(shù)‘龍井長(zhǎng)葉’轉(zhuǎn)錄組庫(kù)(NCBI SRA：SRP128078)中序列信息，利用IDT(http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以‘龍井長(zhǎng)葉’茶樹(shù)葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×Taq Master Mix 25 μL，cDNA模板5 μL，上下游引物各2.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL，程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后用Gel Extraction Kit(OMEGA，美國(guó))試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體(TaKaRa，大連)，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞后送楊凌奧科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3CsLEA5基因生物信息學(xué)分析用BioXM 2.6軟件進(jìn)行基因開(kāi)放閱讀框查找和翻譯，用NCBI中的Blast工具預(yù)測(cè)編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/#TOP)預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)，用ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)預(yù)測(cè)編碼蛋白親/疏水性，用TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測(cè)編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，用WoLF PSORT(http://wolfpsort.org/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.4CsLEA5基因啟動(dòng)子序列分析以CsLEA5基因cDNA序列為探針與茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)[23]進(jìn)行本地Blast比對(duì)，確定CsLEA5基因位置，進(jìn)而獲得起始密碼子上游1 500 bp啟動(dòng)子序列。用PlantCARE在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

表1 引物序列

1.2.5CsLEA5基因的表達(dá)分析根據(jù)基因的全長(zhǎng)序列在非保守區(qū)域設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)，以茶樹(shù)CsPTB1為內(nèi)參基因[24]，按照SYBR?PremixExTaqⅡ(TaKaRa，大連)的說(shuō)明書(shū)對(duì)CsLEA5基因進(jìn)行qRT-PCR分析。PCR 反應(yīng)體系為：SYBR?PremixExTaq10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1μL, RNase free H2O 補(bǔ)至總體積20 μL。在IQ5 Multi-Color Real time PCR Detection System(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線程序采用60 ℃ 30 s，每個(gè)循環(huán)增加0.5 ℃，71個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔΔCT算法進(jìn)行分析[25]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsLEA5基因克隆與序列分析

以茶樹(shù)‘龍井長(zhǎng)葉’葉片cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得一條大小為515 bp特異片段(圖1)，測(cè)序結(jié)果顯示其包含一個(gè)375 bp開(kāi)放閱讀框，編碼124個(gè)氨基酸，與轉(zhuǎn)錄組檢索序列一致，為CsLEA5基因cDNA全長(zhǎng)序列，GeneBank登錄號(hào)為MK050967(圖2，A)。編碼蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示，CsLEA5含有一個(gè)典型的LEA_3保守結(jié)構(gòu)域(Pfam03242)，屬于LEA蛋白的LEA_3亞家族成員(圖2，B)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 6.0對(duì)19個(gè)不同植物的LEA5蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，結(jié)果顯示CsLEA5與醉蝶花、擬南芥、亞麻薺和藜麥中的LEA5親緣關(guān)系較近，推測(cè)其具有類(lèi)似的起源和進(jìn)化關(guān)系。另外，除同一科植物L(fēng)EA5蛋白一致性較高，不同物種間LEA5蛋白一致性整體較低。

M. DNA marker；1. 退火溫度56 ℃；2. 退火溫度58 ℃圖1 茶樹(shù)CsLEA5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DNA marker；1. Annealing temperature 56 ℃； 2. Annealing temperature 58 ℃Fig.1 PCR application of CsLEA5 gene

圖2 CsLEA5基因的cDNA及編碼氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CsLEA5 gene

圖3 CsLEA5與其他植物L(fēng)EA5蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis among CsLEA5 and LEA5 proteins of other plants

2.3 CsLEA5蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，CsLEA5蛋白的分子式為C587H933N171O191S3，分子量為13.5 kD，理論等電點(diǎn)為5.92，有負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)16個(gè)，正電荷殘基(Arg + Lys)13個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為39.22，推測(cè)CsLEA5為穩(wěn)定的酸性蛋白。

2.3.2磷酸化位點(diǎn)與親/疏水性分析磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果如圖4，A所示，CsLEA5含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中以絲氨酸磷酸化位點(diǎn)最多，且多個(gè)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)值在0.90以上，表明其很有可能受到磷酸化作用的調(diào)控。另外，親/疏水預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CsLEA5的親水區(qū)域顯著大于疏水性區(qū)域，GRAVY值為-0.469，表明其屬于親水性蛋白(圖4，B)。

2.3.3跨膜結(jié)構(gòu)域分析跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsLEA5蛋白在11～31位氨基酸處存在一個(gè)由外向內(nèi)的跨膜螺旋，加權(quán)平均分為518(大于模型設(shè)定值500)，推測(cè)其是一個(gè)跨膜蛋白(圖5)。同時(shí)，SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示CsLEA5沒(méi)有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白。另外，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsLEA5定位于線粒體或葉綠體中。

2.4 CsLEA5基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示，CsLEA5基因啟動(dòng)子除包含轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一般元件外，還包含多種與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如厭氧誘導(dǎo)元件(ARE)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)、脅迫響應(yīng)元件(STRE)、創(chuàng)傷響應(yīng)元件(WUN-motif)及MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)。

圖4 CsLEA5磷酸化位點(diǎn)與親/疏水性分析Fig.4 Phosphorylation site prediction and hydrophilicity /hydrophobicity analysis of CsLEA5

2.5 CsLEA5基因的表達(dá)分析

2.5.1組織特異性表達(dá)分析qRT-PCR結(jié)果(圖6)顯示，CsLEA5基因在葉片中的表達(dá)量最高，莖中次之，而在根和花中的表達(dá)量較低，其表達(dá)具有明顯的組織特異性。

2.5.2低溫和干旱脅迫下的表達(dá)分析低溫脅迫下，茶樹(shù)葉片中CsLEA5基因的表達(dá)量爆發(fā)式增加，在4 h達(dá)到最高，為對(duì)照的80多倍，之后開(kāi)始逐漸降低，于48 h降至對(duì)照水平，整體呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢(shì)(圖7)，表明低溫脅迫顯著誘導(dǎo)了茶樹(shù)葉片中CsLEA5基因的表達(dá)。干旱脅迫下，茶樹(shù)葉片中CsLEA5基因的表達(dá)量逐漸增加，在2 h達(dá)到峰值，后逐漸降低到較低的水平，之后又逐漸增加，整體呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)(圖7)，表明CsLEA5基因同樣受到干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 CsLEA5跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Transmembrane domains analysis of CsLEA5

元件Element數(shù)量Amount序列Sequence功能FunctionAC-I1TCACCCACCCACC 光響應(yīng)元件Light responsive elementARE2AAACCA厭氧誘導(dǎo)元件Essential for the anaerobic inductionAT-rich element2ATAGAAATCAADNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)Binding site of DNA binding protein (ATBP-1)Box-47ATTAAT光響應(yīng)元件Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessCAAT-box19CAAT啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域共有元件Common element in promoter and enhancer regions CCAAT-box1CAACGGMYBHv1結(jié)合位點(diǎn)MYBHv1 binding siteERE6ATTTTAAA 乙烯響應(yīng)元件Ethylene responsive elementGA-motif2ATAGATAA 光響應(yīng)元件Part of a light responsive elementMYB recognition site 1CCGTTGMYB識(shí)別位點(diǎn)MYB recognition siteMYC2CAATTG/CATGTGMYC識(shí)別位點(diǎn)MYC recognition siteSTRE2AGGGG脅迫響應(yīng)元件Stress responsive elementTATA-box22TATA核心啟動(dòng)元件Core promoter elementWUN-motif1AAATTTCCT 創(chuàng)傷響應(yīng)元件Wound responsive element

不同字母表示不同組織間的差異顯著(P<0.05)圖6 CsLEA5基因在不同組織的表達(dá)情況 Different letters represent significant differences among different tissues (P<0.05)Fig.6 Relative expression level of CsLEA5 gene in different tissues

不同字母表示同一處理不同時(shí)間的差異顯著(P<0.05)圖7 CsLEA5基因在低溫和干旱脅迫下的表達(dá)分析 Different letters represent significant differences among different time points within same treatment (P<0.05)Fig.7 Expression analysis of CsLEA5 gene under cold and drought stress

3 討 論

LEA蛋白作為一類(lèi)重要的抗逆蛋白在植物抵御非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其功能機(jī)制受到越來(lái)越多的關(guān)注[26-30]。目前，從各種植物中克隆獲得了大量LEA蛋白編碼基因，但在茶樹(shù)上關(guān)于LEA基因的報(bào)到非常有限。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上克隆獲得了茶樹(shù)的CsLEA5基因，其編碼氨基酸序列含有一個(gè)典型的LEA_3保守結(jié)構(gòu)域，屬于LEA蛋白中LEA_3亞家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示CsLEA5與醉蝶花、擬南芥、亞麻薺和藜麥中的

LEA5親緣關(guān)系較近，但彼此間一致性較低，這符合LEA蛋白間具有較低一致性的特點(diǎn)[31]。

眾多研究表明，植物L(fēng)EA基因的表達(dá)具有組織特異性，如玉米ZmLEA5C在種子中特異性表達(dá)[10]，西瓜ClLEA3-1在根中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織[14]，而花生LEA2則在葉片中特異性表達(dá)[27]。本研究中，茶樹(shù)CsLEA5基因在不同組織中的表達(dá)量亦存在明顯差異，在葉片中表達(dá)量最高，其次是嫩莖，而在根和花中的表達(dá)量較低，推測(cè)其在茶樹(shù)新稍生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用。另一方面，越來(lái)越多的證據(jù)表明植物L(fēng)EA基因的表達(dá)受各種環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)，從而參與植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程，其中賈會(huì)麗等的研究表明紫花苜蓿MsLEA4-4基因的表達(dá)受干旱、高鹽、ABA及多種重金屬脅迫的誘導(dǎo)[32]；張業(yè)猛等[33]研究顯示蒺藜苜蓿MtLEA5B基因受低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫的誘導(dǎo)；滑璐玢等[34]研究表明檸條錦雞兒CkLEA4-1基因的表達(dá)受干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)。本研究的qRT-PCR結(jié)果顯示，CsLEA5基因在低溫、干旱脅迫下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，這與西瓜ClLEA3-1、玉米ZmLEA3在低溫、干旱脅迫下的表達(dá)水平變化一致[11,14]，表明CsLEA5在茶樹(shù)抵御低溫、干旱脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。眾所周知，啟動(dòng)子對(duì)調(diào)控基因的表達(dá)是至關(guān)重要的。本研究發(fā)現(xiàn)，CsLEA5基因啟動(dòng)子序列中包含多種逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如乙烯響應(yīng)元件(ERE)、脅迫響應(yīng)元件(STRE)及MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)等，表明CsLEA5基因的表達(dá)可能受相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。同時(shí)，大量研究證實(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子以及ERF/DREB乙烯響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫和干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中對(duì)下游功能蛋白基因的表達(dá)具有廣泛調(diào)控作用[35]，因此推測(cè)低溫、干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)中CsLEA5基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能依賴(lài)于上游MYB、ERF/DREB等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

目前，關(guān)于逆境脅迫下LEA蛋白的作用機(jī)制主要有脫水保護(hù)劑的作用、對(duì)其他蛋白質(zhì)或膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用、滲透調(diào)節(jié)作用和離子鰲合劑的作用[36]，而LEA蛋白的高親水性和穩(wěn)定性是上述功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[37-38]。本研究中對(duì)CsLEA5蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示其具有較高親水性和穩(wěn)定性，這可能對(duì)提高茶樹(shù)低溫、干旱脅迫抗性有重要意義，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。