吳建民，梁 靚，王建發(fā)，武 瑞

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

鸚鵡屬于鸚形目（Psittaciformes），有鸚鵡科和鳳頭鸚鵡科2個科、82個屬、358個種，是當今鳥綱中最大的科之一，屬于典型的攀禽，分布在世界各地的熱帶地區(qū)。鸚鵡以其靚麗的羽毛以及能夠模仿人類語言等特點，被大多數(shù)人欣賞和愛護，因而經(jīng)常被人們作為寵物飼養(yǎng)，而它們的野生種群也因此受到了威脅，許多種類都已經(jīng)成為瀕危物種[1]。

性別是鸚鵡最重要的特征之一，雌雄個體的鸚鵡通常在其生理、行為等方面都具有不同之處。而鸚鵡的性別鑒定，特別是早期的性別鑒定對它們的飼養(yǎng)管理、繁殖與育種、遺傳疾病防治、種群結(jié)構(gòu)和群體遺傳分析等方面都具有非常重要的意義，特別是對已經(jīng)處于瀕危邊緣鸚鵡的保護和管理具有重要作用[2]。鸚鵡性別鑒定常見的方法主要分為3類，即形態(tài)學鑒定法、細胞生物學鑒定法和分子生物學鑒定法[3-5]。

1 鸚鵡性別鑒定的形態(tài)學方法

1.1 行為判定法

鳥類行為學一般是指研究鳥類行為特征以及表現(xiàn)出某種行為的原因的一門學科，側(cè)重于描述行為以及對行為機理的探索[6-7]。應用該種方法對虎皮鸚鵡進行觀察發(fā)現(xiàn)，雄性鸚鵡一般會喂食給另外一只成年鸚鵡，而雌性鸚鵡只會喂養(yǎng)幼鳥；雌性鸚鵡相對于雄性鸚鵡更容易用喙啄人。但是僅憑這些特征并不能完全確定一只鸚鵡的性別。

1.2 翻肛判定法

翻肛法就是通過觀察鸚鵡的泄殖腔而對其性別做出鑒定的方法。該種方法通過觀察1日齡幼鳥的泄殖腔內(nèi)是否具有待發(fā)育的雄鳥生殖器從而確定其性別。經(jīng)驗豐富的人員能達到95%的鑒別準確率，而非專業(yè)人員最多只能達到60%～70%的準確率[8]。

1.3 外科手術(shù)判定法

外科手術(shù)判定法一般是指通過腹腔鏡檢對鸚鵡性別做出鑒定，是一種直接對鸚鵡的生殖系統(tǒng)進行觀察的鑒別方法。與亞成體（動物幼體經(jīng)過變態(tài)后外形與成體完全相似但性腺尚未成熟的發(fā)育階段）相比，成鳥的性腺組織更容易成像。在成像過程中，亞成體雄鳥的睪丸小而且表面無血管分布，而性成熟雄鳥的睪丸表面分布有血管，體積更大并且因季節(jié)不同大小存在差異。亞成體雌鳥的卵巢通常具有顆粒狀的表面，而性成熟雌鳥卵泡則呈現(xiàn)出葡萄簇狀。腹腔鏡檢法的主要缺點是需要對鸚鵡個體進行麻醉，鑒定過程存在對重要器官造成傷害的風險，甚至危及鸚鵡的生命[8]。

1.4 排泄物類固醇判定法

該種方法是基于鸚鵡排泄物中存在的雌二醇與睪酮的相對水平（E/T）來進行性別判斷。雌鳥排泄物中的E/T比雄鳥高。但是在進行該種方法檢驗時，要求所分析的排泄物試樣必須是新鮮的。繁殖與非繁殖季節(jié)以及年齡等因素之間的交互作用在很大程度上影響著鸚鵡排泄物中的激素比例，甚至會對鑒別結(jié)果產(chǎn)生干擾，并且由于激素在卵中和發(fā)育的胚胎中為非均勻分布，因此，取樣方法是至關(guān)重要的。鑒于上述因素，該種方法適用于處在繁殖季節(jié)的成鳥。從方法和技術(shù)層面來看，鸚鵡排泄物中激素測定的準確性和特異性尚存在不穩(wěn)定性，需要更多的試驗加以驗證。

1.5 叫聲判定法

鸚鵡屬于鳴禽類，而鳴禽在鳴囀行為上表現(xiàn)出明顯的性別以及個體差異。通常雄鳥善于鳴囀，而雌鳥則很少或幾乎不鳴囀。近年來，國內(nèi)外研究表明鳥類復雜的發(fā)聲行為與體內(nèi)的性激素有著密切關(guān)系[9]，同時，與控制發(fā)聲學習的神經(jīng)核團的發(fā)育和成熟也存在相關(guān)性[10]。成年鳴禽的發(fā)聲控制神經(jīng)核團存在性別差異，因此，造成雌雄發(fā)聲行為存在區(qū)別[11-13]。

1.6 體尺測量法

該種方法是指對鸚鵡的外形大小、個體高矮、頭額寬度、翅膀和尾巴長度等參數(shù)進行測量比較來鑒定性別[14]。雄性鸚鵡個體頭部略大、近似圓形，體重略重于雌性鸚鵡；而雌性鸚鵡頭部略呈扁圓形。該方法雖然操作簡單，但是準確性不高。

1.7 羽色伴性遺傳法

該方法是指依據(jù)雌雄鸚鵡個體外表不同的羽毛顏色作為性別鑒定的方式，是一種非常直觀的性別鑒定方法，操作簡單且方便，但前提是必須要有羽色性連鎖基因存在于待鑒定的鸚鵡種系基因之中。在該種鑒定方法中，應按照設(shè)計的雜交程序，選擇出具有羽色性連鎖基因的純合系后代。該種方法的缺點是并非所有種系的鸚鵡都適用[15]。

1.8 其他形態(tài)學鑒定方法

以虎皮鸚鵡為例，成年雄性鸚鵡鼻孔區(qū)域的蠟膜通常為深藍色或紫色，并且質(zhì)地比較光滑；成年雌性鸚鵡的蠟膜通常為肉色、粉紅色或褐色，并且質(zhì)地較硬。但是，非成年鸚鵡或者出現(xiàn)基因突變的鸚鵡則無法進行判斷。

在以上的鸚鵡形態(tài)學性別鑒定方法中都存在缺點，有些方法消耗時間，有些方法操作復雜，有些方法直接對鸚鵡本身產(chǎn)生較大的傷害，還有的方法判斷正確率很低，并且需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作，這對于處于瀕危狀態(tài)的珍稀鳥類來說并不適合[3-5]。

2 鸚鵡性別鑒定的細胞生物學方法

鸚鵡的性染色體中，雌性鸚鵡為異配性別，由Z和W染色體共同組成，而雄性是同配性別，擁有2個Z染色體，這與大多數(shù)哺乳動物的性染色體配對方式相反。在對鸚鵡的性別染色體進行分離和核型分析后發(fā)現(xiàn)，染色體主要來源于新生羽毛中的細胞以及血液細胞的培養(yǎng)物之中，而且鸚鵡的大多數(shù)染色體均屬于小染色體。也就是說，要保證染色體的數(shù)目分辨正確率是很難做到的。利用性染色體對鸚鵡進行性別鑒定是可行的，有研究表明，異配性別雌鳥的W性染色體與其他的小染色體差別較大，而較大的Z染色體與較小的W染色體是易于區(qū)分的[6]。但是核型分析法的缺點是培養(yǎng)獲得可用細胞有難度并且操作過程比較費時。

3 鸚鵡性別鑒定的分子生物學方法

隨著科學技術(shù)的不斷進步，分子生物學方法已經(jīng)成為一種重要的鸚鵡性別鑒定方法。大部分的分子生物學性別鑒定方法均是以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎(chǔ)的。染色體的本質(zhì)是DNA，因而后者可以作為鸚鵡性別鑒定可信度極高的物質(zhì)基礎(chǔ)。血液和羽毛可用作提取DNA的樣本來源。利用從羽毛中提取出的DNA對鸚鵡進行性別鑒定，被稱為組織性別鑒定法。但是DNA只能在羽毛軸端提取，因而該種方法存在一定的操作難度。一般來講，用3～5根新拔的腹羽就足夠提供試驗所需的樣本量，此外，羽毛還可以在分析處理之前冷凍保存；而且運用羽毛進行DNA的提取能夠降低應激反應，避免對鸚鵡造成過度傷害。研究人員依據(jù)核DNA含量的不同，采用流式細胞分析法實現(xiàn)了3種不同鸚鵡的性別鑒定，即亞馬孫鸚鵡、虎皮鸚鵡和雞尾鸚鵡[6]。利用羽毛樣本進行DNA分析，可以在早期對鸚鵡的性別做出鑒定，并且對鸚鵡個體的傷害較小。

3.1 隨機擴增多態(tài)性DNA

利用隨機擴增多態(tài)引物擴增獲得的DNA片段可用來進行性別鑒定。如果選擇的隨機擴增引物位于W染色體上，擴增產(chǎn)物只能在雌性鸚鵡中獲得，該位點即可成為雌鳥的特異性標記[8]。但是，隨機擴增多態(tài)性DNA本身具有一些缺點，包括擴增條件的敏感性導致重復性差，低效率擴增和不同片段擴增競爭導致出現(xiàn)更多非特異條帶等問題。

3.2 微衛(wèi)星

研究表明，基因組中含有許多短的銜接重復序列。當這些短的重復序列的重復單位是2～4個堿基對時，則稱為短串連重復序列或微衛(wèi)星[6]。但是，利用該種方法進行性別鑒定時，由某些原因造成的PCR擴增失敗會導致將雌鳥判斷為雄鳥。研究發(fā)現(xiàn)，通過使用放射性標記引物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，能夠減少該種誤判[8]。

3.3 小衛(wèi)星

小衛(wèi)星又被稱為數(shù)目可變串聯(lián)重復位點。有研究表明，在利用人的小衛(wèi)星探針33.15對南美13個屬中的33個種的鸚鵡進行性別鑒定時發(fā)現(xiàn)，該探針在金剛鸚鵡種和錐尾鸚鵡種的性別鑒定上很有意義，但是該方法對一些短尾鸚鵡種和長寬尾鸚鵡種則不可用[6]。

3.4 CHD1基因

有研究表明，鸚鵡的CHD基因位于性染色體上，其在鸚鵡中有2個同源拷貝，即CHD-W和CHD-Z。其中，CHD-W為W連鎖，CHD-Z為Z連鎖[16-17]。 1995 年，Griffith 和 Tiwari[18]首次發(fā)現(xiàn)了與W染色體連鎖的CHD-W基因，全稱為染色體螺旋蛋白基因 （chromobox helicase-DNA binding gene）。隨后的試驗表明，該基因非常保守，幾乎所有的非平胸類鳥類都含有CHD-W基因[19]，因而該基因開始被用于鳥類性別鑒定中。

運用CHD基因做出性別鑒定的方法主要通過2個途徑實現(xiàn)。第1個途徑是運用特異性引物對Z和W 2個染色體的特異性序列進行PCR擴增，再運用限制性內(nèi)切酶對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切。因為CHD-W基因上有特異性酶切位點，所以在對酶切產(chǎn)物進行電泳時，雌性會產(chǎn)生3條帶，而雄性則為1條帶。第2個途徑是直接運用特異性引物對Z和W 2個染色體上不同大小的特異性序列進行PCR擴增，其檢測結(jié)果顯示為：雌性產(chǎn)生2條帶，雄性產(chǎn)生 1 條帶[20]。

研究表明，已經(jīng)篩選出一些能夠?qū)HD基因中內(nèi)含子長度進行測定的引物。其中，最普遍的引物為P2-P8引物對和1237L-1237H引物對[21]。根據(jù)相關(guān)學者的報道，利用P2-P8引物對可以對金剛鸚鵡科進行性別鑒定[6]，并且準確率較高。還有研究通過使用P2-P8引物對來對雞尾鸚鵡進行性別鑒定[22]。因為雌性是異配性別，雄性是同配性別，因此，經(jīng)過5%瓊脂糖凝膠電泳后，產(chǎn)生2條帶的為雌性，而只有1條帶的為雄性。

4 展望

有研究顯示，雌雄鳥類自身所分泌的雌雄激素在體內(nèi)的含量不同，而雌雄激素的含量水平是決定鳥類性別的關(guān)鍵因素。由雄鳥睪丸所分泌的雄性激素和由雌鳥卵巢所分泌的雌性激素可以激發(fā)并維持雄雌鳥的第二性征。有試驗表明，割除或者移植公雞與母雞的生殖腺，會產(chǎn)生性別逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，也就是原來的母雞逐漸產(chǎn)生了公雞的外表特征和行為特征，例如長出了公雞型的雞冠和色彩鮮明的長尾羽毛等，而原來的公雞也逐漸產(chǎn)生了母雞的外表特征和行為特征。在該基礎(chǔ)之上，首先通過鑒別已知性別鸚鵡體內(nèi)的雌雄激素水平及比例，確定雌雄鸚鵡的激素分界水平，然后利用體內(nèi)激素水平的含量數(shù)值，進而確定未知鸚鵡的性別，以達到鑒別鸚鵡性別的目的。

5 結(jié)語

綜上所述，在實際工作中，具體采用何種方法對鸚鵡的性別進行鑒定，主要取決于操作條件、實驗室的設(shè)備以及技術(shù)人員的經(jīng)驗。一般來講，應用PCR方法進行鸚鵡性別鑒定具有以下優(yōu)點：采樣量?。?根羽毛），對鸚鵡造成的應激較?。焕梅€(wěn)定遺傳的基因組DNA來進行性別鑒定，結(jié)果更可靠，同時對于剛出生的雛鳥也同樣適用[23]；可以同時檢測大量樣品，高效快捷。目前，鸚鵡性別鑒定的分子生物學方法主要被科研機構(gòu)和一些專門從事鳥類性別鑒定的商業(yè)公司應用，但是隨著鸚鵡育種、瀕危鸚鵡物種保護以及進化研究等方面的工作越來越受到重視，該種方法的應用范圍必將逐漸擴大，并且會產(chǎn)生廣闊的市場前景。而能否真正通過驗證激素水平的方法達到鑒別鸚鵡性別的目的還有很多的工作要做。以上的思路和方法都以現(xiàn)今的科學技術(shù)手段作為支持，但能否基于這些技術(shù)開發(fā)新的鸚鵡性別鑒定方法，還需要廣大研究人員進一步探索。