王悅良，陳豪特，代 波，王權(quán)勝△

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023)

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

1.2 主要儀器

MACRO精子計(jì)數(shù)板和WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)，北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司；DL-4ZB 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；掃描電子光學(xué)顯微鏡，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供；廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供觀察分析服務(wù)。

1.3 藥物制備

1.3.2 邁之靈片 德國(guó)禮達(dá)大藥廠生產(chǎn)(注冊(cè)證號(hào) Z20050017)，150 mg/片。

1.4 動(dòng)物模型制作方法

將實(shí)驗(yàn)大鼠用普通飼料飼養(yǎng)1周, 觀察無(wú)明顯異常后即進(jìn)行造模，模型的制作方式參照Turner腎靜脈縮窄術(shù)[2]。SD大鼠以10%的水合氯醛腹腔肌注麻醉(1 ml/300 g)，麻醉成功后應(yīng)用大鼠板固定。取大鼠劍突下腹部正中切口逐層切開(kāi)，將腹內(nèi)容物輕推向右上腹，于左側(cè)腹膜后顯露左腎靜脈，游離部分左腎靜脈后，在左腎上腺靜脈與腹背靜脈之間的左腎靜脈放置一直徑約0.85 mm的金屬桿，以4-0的絲線將金屬桿與左腎靜脈一并結(jié)扎，結(jié)扎完成后小心抽出金屬桿，可見(jiàn)左腎靜脈恢復(fù)充盈擴(kuò)張。觀察2 min，確定左腎無(wú)缺血后將腹內(nèi)容物歸位，并逐層縫合切口。于造模術(shù)后1個(gè)月麻醉解剖觀察，按照精索靜脈曲張模型建立成功的標(biāo)志：左精索靜脈直徑>1 mm，測(cè)量直徑比假手術(shù)組擴(kuò)張3倍以上，雙腎質(zhì)量無(wú)明顯差別即提示精索靜脈曲張性不育模型造模成功。假手術(shù)組只需進(jìn)行左腎靜脈的剝離，不予結(jié)扎左腎靜脈。各組大鼠在術(shù)后5 d內(nèi)，每天肌注青霉素鈉40萬(wàn)U/只。

1.5 給藥方法

2 觀察及檢測(cè)方法

2.1 標(biāo)本的制作及觀察方法

于末次給藥后24 h各組大鼠稱重?cái)囝i處死,剪開(kāi)陰囊,各組大鼠均摘取左側(cè)睪丸組織,用冷生理鹽水沖洗,除去血液稱其質(zhì)量,迅速置于盛有6 mL生理鹽水的平皿內(nèi),適當(dāng)加以剪碎置于約37℃溫水中溫浴20 min左右，輕輕搖晃混勻以使睪丸內(nèi)的精子充分游離,用精子計(jì)數(shù)板檢測(cè)精子濃度和活率。按《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》[3]標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定精子質(zhì)量；將部分睪丸組織用Bouin’s液固定24 h,梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟切片包埋,HE染色,光鏡下觀察睪丸組織及生精上皮等改變；將大鼠睪丸組織切取約1 mm3大小放入2%戊二醛和1%多聚甲醛混合液中行固定處理后，送廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)室觀察其超微結(jié)構(gòu)。

2.2 大鼠睪丸組織顯微超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

光鏡下觀察各組附睪丸組織常規(guī)病理變化，如精子細(xì)胞、曲精小管、生精上皮等結(jié)構(gòu)變化；電鏡下觀察左側(cè)睪丸超微結(jié)構(gòu)改變，如生精上皮、間質(zhì)血管、支持細(xì)胞，主細(xì)胞溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況

3.2 左精索靜脈直徑及睪丸質(zhì)量量變化

模型組大鼠左精索靜脈直徑較假手術(shù)組明顯曲張,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組大鼠左側(cè)睪丸質(zhì)量與假手術(shù)組左側(cè)睪丸質(zhì)量比較明顯減輕(P<0.05)；模型組大鼠右側(cè)睪丸質(zhì)量(1.79±0.05)g，相對(duì)假手術(shù)組(1.84±0.06) g差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模各組大鼠左側(cè)睪丸質(zhì)量較右側(cè)減輕明顯。

3.3 對(duì)睪丸精子質(zhì)量的影響

表1 各組大鼠附睪精子質(zhì)量比較

注:與模型組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01；與邁之靈組比較:△P<0.05

3.4 對(duì)大鼠睪丸顯微超微結(jié)構(gòu)的影響

注：A.假手術(shù)組;B.模型組; C.邁之靈組; D.大黃蟲丸組圖1 各組大鼠睪丸組織光鏡圖(HE染色 ×200)

注：A.假手術(shù)組;B.模型組; C.邁之靈組; D.大黃蟲丸組圖2 各組大鼠睪丸組織電鏡圖(×30000)

4 討論

精索靜脈曲張是青壯年男性的常見(jiàn)病和多發(fā)病，發(fā)病率約占男性人群的10%～15%，精索靜脈曲張可使睪丸內(nèi)環(huán)境發(fā)生病理改變，影響精子發(fā)生發(fā)育，造成精子濃度及活率下降，精子細(xì)胞形態(tài)上不成熟和畸形精子的數(shù)量顯著增多，從而影響男性不育[4]。但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界對(duì)精索靜脈曲張導(dǎo)致的男性不育機(jī)制尚未形成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，有報(bào)道指出精索靜脈曲張導(dǎo)致的不育可能與睪丸內(nèi)組織細(xì)胞凋亡、激素分泌、自身免疫、氧化應(yīng)激等諸多因素相互作用致精子生成障礙有密切關(guān)聯(lián)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)精索靜脈曲張模型大鼠睪丸精子濃度及活動(dòng)率觀察并結(jié)合顯微超微結(jié)構(gòu)改變發(fā)現(xiàn)，大鼠精子質(zhì)量與睪丸內(nèi)環(huán)境的變化有某種必然的聯(lián)系。一方面，精索靜脈曲張可導(dǎo)致附睪血液滯留瘀積，回流緩慢，使睪丸組織缺血缺氧和必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生供應(yīng)障礙，致使生精上皮損傷，各級(jí)生精細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中出現(xiàn)獲能中斷，可致精子濃度降低，形態(tài)畸形率增加。另一方面，睪丸內(nèi)有毒物質(zhì)的異常蓄積，使血管內(nèi)皮受損及活性物質(zhì)異常釋放，促使某些誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子過(guò)度表達(dá)，改變睪丸組織顯微超微結(jié)構(gòu)、蛋白酶學(xué)的生成和分泌，影響精子發(fā)生發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定性。