王書珍， 黃興學(xué)， 王斌才， 張 霖， 周國林， 汪愛華

(1.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃岡 438000；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院蔬菜科學(xué)研究所，湖北武漢 430065)

生菜(LactucasativaL.)(2n=18)是菊科萵苣屬1～2年生草本植物，原產(chǎn)地中海沿岸，現(xiàn)為全世界范圍廣泛種植食用的低糖、低脂類葉用類蔬菜，因能夠分解亞硝胺等致癌物質(zhì)被稱為“抗癌蔬菜”，其根據(jù)葉片的長勢分為結(jié)球生菜、半結(jié)球生菜、散葉生菜等多種類型[1-2]。生菜富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、核黃素、膳食纖維等活性成分，具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。近年來，隨著生活水平的提高，人們對蔬菜、水果以及農(nóng)作物等的品質(zhì)要求不斷提高，對生菜的品質(zhì)要求也是逐漸提高[4]。

品質(zhì)性狀是數(shù)量性狀或數(shù)量-質(zhì)量性狀，其受多基因控制，且其表型極易受到周圍環(huán)境的影響[4]?？刂破焚|(zhì)性狀的基因常為隱性基因，傳統(tǒng)的品質(zhì)檢測繁瑣且費(fèi)用較高，因此農(nóng)作物的品質(zhì)改良工作進(jìn)展緩慢。然而，尋找與品質(zhì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記并用于分子標(biāo)記輔助育種中，將大大提高品質(zhì)性狀的遺傳改良效率。微衛(wèi)星(simple sequence repeat，SSR)分子標(biāo)記，是基因組中1～6個(gè)核苷酸多次串聯(lián)重復(fù)組成的序列，數(shù)量豐富、共顯性遺傳、多態(tài)性高，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、關(guān)聯(lián)分析、基因定位、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、物種進(jìn)化等研究中[5-6]。

本研究選用51份生菜資源構(gòu)建自然群體，采用SSR標(biāo)記分析其遺傳多樣性，并結(jié)合關(guān)聯(lián)分析，挖掘蛋白質(zhì)、硝酸鹽、可溶性糖、硝酸鹽含量等營養(yǎng)品質(zhì)性狀的優(yōu)異等位變異，為生菜品質(zhì)性狀遺傳改良育種奠定分子基礎(chǔ)，也為分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從國家生菜種質(zhì)資源庫中挑選51份表型差異較大的資源，分別于2015、2016年秋季種植在武漢市蔬菜科學(xué)研究所的試驗(yàn)基地(114°20′E、30°37′N)，種植2季，常規(guī)日常管理和病蟲害防治，

定植株行距為25 cm，各品種種植30～50株。

1.2 營養(yǎng)品質(zhì)性狀測定

每個(gè)品種選取長勢一致且健康的植株5株，在同一位置采摘葉片，低溫保存后迅速進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)的測定，各試驗(yàn)重復(fù)3次。蛋白質(zhì)含量的測定采用微量凱氏定氮法[7]；采用硝酸鹽試粉法測定新鮮葉片組織中的硝酸鹽含量[8]。采用蒽酮法測定生菜嫩葉的可溶性糖含量[9]。利用近紅外光譜技術(shù)測定生菜葉片纖維素的含量[10]。

1.3 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

每個(gè)品種隨機(jī)選5株，每株采集3張健康嫩葉，硅膠干燥并自封袋封存。采用改良的CTAB法提取基因組DNA，稀釋到100 ng/μL[11]。依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的生菜EST序列信息，設(shè)計(jì)合成80對SSR引物。PCR反應(yīng)體系(15 μL)：1 μL的基因組DNA(100 ng/μL)，20 mmol/L正反向引物各0.15 μL，7.5 μL的2×TaqPCR Mastermix，滅菌的去離子水補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，最適退火溫度下退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)20 bp DNA marker的電泳譜帶，統(tǒng)計(jì)不同個(gè)體相應(yīng)位點(diǎn)上等位基因的大小。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)電泳圖譜構(gòu)建“0/1”二元矩陣：同一電泳位置上有帶記為“1”，無帶記為“0”。對蛋白質(zhì)、硝酸鹽、可溶性糖、纖維素含量的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和聚類分析，統(tǒng)計(jì)各性狀的平均值、變異系數(shù)、重復(fù)力(R)大小[12]。使用Arlequin 3.1軟件統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)(Na)、期望雜合度(HE)、觀察雜合度(HO)等多樣性參數(shù)[11，13]。利用PICCalc 0.6軟件計(jì)算各標(biāo)記的多態(tài)性信息(PIC)含量。采用NTSYS-PC(version 2.2)軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，根據(jù)遺傳距離構(gòu)建聚類圖[14]。根據(jù)遺傳距離矩陣分析SSR標(biāo)記位點(diǎn)與形態(tài)性狀的相關(guān)性[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生菜營養(yǎng)品質(zhì)性狀分析

本研究所選的51份生菜資源變異較大，方差分析表明，4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀在不同的生菜資源間均達(dá)到極顯著水平。生菜葉片蛋白質(zhì)平均含量高達(dá)10.914 mg/g，硝酸鹽平均含量為1.016 mg/g，可溶性糖平均含量為2.286%，而纖維素平均含量為0.019%(表1)。蛋白質(zhì)含量的變化幅度最大，為 2.211～35.423 mg/g，極差高達(dá)33.213 mg/g。4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀的變異系數(shù)(CV)在0.124%～0.624%間變化，其中蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)最大，最小的是纖維素含量。4個(gè)品質(zhì)性狀的重復(fù)力(R)變化范圍為0.865～0.973，重復(fù)力最低的是纖維素含量，最高的是蛋白質(zhì)含量(表1)。

依據(jù)4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀構(gòu)建的聚類分析圖，51份生菜資源被分為兩大類，LS1、LS2、LS23等3份生菜構(gòu)成第1類，其余的48份被聚為第2類(圖1)。在遺傳距離3.73處，第二大類又被分為2個(gè)小類，分別包括LS3、LS11等在內(nèi)的21份資源和包括LS4、LS17等在內(nèi)的27份資源。營養(yǎng)品質(zhì)性狀類似的生菜品種被聚到一起，研究發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與地理起源并不一致。

表1 各品種間品質(zhì)性狀變異情況

2.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

在所設(shè)計(jì)合成的80個(gè)EST-SSR標(biāo)記中有34個(gè)能夠特異性擴(kuò)增出目的大小的DNA片段，且重復(fù)性強(qiáng)；12個(gè)以(AG)n或者(CT)n為重復(fù)基序的標(biāo)記在51份生菜資源中是多態(tài)的。多態(tài)性SSR標(biāo)記的退火溫度為53～58 ℃，微衛(wèi)星基序重復(fù)次數(shù)介于24～27次之間。12個(gè)標(biāo)記共擴(kuò)增出等位基因類型62種，片段大小為124～237 bp。每個(gè)標(biāo)記檢測到的等位基因數(shù)為3～9個(gè)，平均為5.167個(gè)。標(biāo)記LswSS10檢測到的等位基因數(shù)最多，為9個(gè)，其次是LswSS6，檢測到8個(gè)等位基因位點(diǎn)。LswSS1、LswSS9、LswSS11等3個(gè)SSR標(biāo)記擴(kuò)增效率最低，僅擴(kuò)增出3個(gè)等位基因(表2)。

觀察雜合度(HO)和期望雜合度(HE)的變化范圍分別為0.00～0.273和0.545～0.842，平均值分別為0.106和0.687(表2)。12個(gè)標(biāo)記間的連鎖不平衡度并未達(dá)到極顯著水平，并且12個(gè)位點(diǎn)處均出現(xiàn)HO小于HE的情況，即雜合子嚴(yán)重缺失。LswSS4、LswSS5、LswSS7、LswSS8等4個(gè)位點(diǎn)的HO均為0，即此4個(gè)位點(diǎn)在檢測的生菜資源中均是純合位點(diǎn)。多態(tài)性信息含量(PIC)值變化范圍為0.428～0.803，平均為 0.614。除了LswSS11標(biāo)記，其余11個(gè)位點(diǎn)的PIC值均大于或等于0.500，即生菜資源內(nèi)存在豐富的遺傳多樣性。

2.3 營養(yǎng)品質(zhì)性狀與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析

將4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀的距離矩陣與SSR標(biāo)記的距離矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析，擬合方程為y=0.464 8x+1.322，二者的相關(guān)系數(shù)為-0.02841，相關(guān)性并不顯著。為了分析每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)對4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀的貢獻(xiàn)率，將4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，12個(gè)SSR擴(kuò)增帶譜也分別聚類，再將蛋白質(zhì)、硝酸鹽、可溶性糖和纖維素含量等4個(gè)性狀的距離矩陣與單個(gè)SSR標(biāo)記聚類的距離矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析。在進(jìn)行的兩兩相關(guān)分析中，并未找到與蛋白質(zhì)含量和硝酸鹽含量性狀關(guān)聯(lián)的SSR分子標(biāo)記。LswSS1和LswSS11兩個(gè)標(biāo)記與生菜葉片可溶性糖含量顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.214和 -0.260(表3)。與纖維素含量相關(guān)的SSR標(biāo)記有3個(gè)，分別為LswSS1(r=-0.366)、LswSS3(r=-0.208)以及LswSS12(r=-0.261)。然而，包括LswSS2、LswSS4、LswSS5、LswSS6、LswSS7、LswSS8、LswSS9、LswSS10等在內(nèi)的8個(gè)SSR標(biāo)記與四個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀的相關(guān)性都不顯著。

表2 12個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記信息

表3 與品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記信息

3 討論與結(jié)論

關(guān)聯(lián)分析(association analysis)是利用基因或者標(biāo)記間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)關(guān)系，對表型性狀與基因或標(biāo)記位點(diǎn)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，從而鑒定與表型變異相關(guān)的基因位點(diǎn)[15]。關(guān)聯(lián)分析采用的是自然群體，研究周期短，且可以同時(shí)分析同一位點(diǎn)上的多個(gè)等位基因，自然群體在長期進(jìn)化過程中積累了大量的重組信息，做出來的關(guān)聯(lián)圖譜精確度也比較高[16]。于志遠(yuǎn)等利用關(guān)聯(lián)分析方法檢測到11個(gè)與大豆蛋白質(zhì)含量極顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，解釋率為2.65%～9.08%[17]。馮英娜等篩選到與茄子農(nóng)藝相關(guān)性狀顯著相關(guān)(P<0.05)的SSR標(biāo)記17個(gè)[18]。嚴(yán)玫等采用關(guān)聯(lián)分析法檢測出與花生品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)4個(gè)，總等位變異位點(diǎn)40個(gè)[19]。

生菜葉片的營養(yǎng)品質(zhì)性狀屬于連續(xù)變異的數(shù)量性狀，是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，其遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，目前由于很難找到表現(xiàn)型和基因型之間的對應(yīng)關(guān)系，因此品質(zhì)性狀機(jī)理和遺傳改良等研究十分困難。本研究將51份生菜資源種植在條件一致的苗圃地，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，最大程度上消除了環(huán)境因素引起的個(gè)體表型差異。本研究共檢測到的12個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均出現(xiàn)觀察雜合度顯著低于期望雜合度的現(xiàn)象，可能的原因是在生菜長期選育過程中，部分位點(diǎn)出現(xiàn)了極大的純合化。最后利用關(guān)聯(lián)分析法篩選出2個(gè)與生菜葉片可溶性糖含量相關(guān)的SSR標(biāo)記，3個(gè)與纖維素含量相關(guān)的SSR標(biāo)記，并且LswSS1標(biāo)記與2個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀均相關(guān)。

本研究篩選到的營養(yǎng)品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記對于后期克隆生菜營養(yǎng)品質(zhì)性狀相關(guān)目的基因意義重大，本研究結(jié)果也為生菜品質(zhì)性狀的遺傳改良和新品種選育奠定了基礎(chǔ)。然而，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與性狀間關(guān)系及作用機(jī)理和方式尚不清楚，而進(jìn)行全基因組的關(guān)聯(lián)分析則能找出更多與品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，后續(xù)仍需更加深入的研究。