包學(xué)文， 李和平， 施 欽， 華建峰， 蘆治國

(1.南京森林警察學(xué)院，江蘇南京 210023； 2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014)

我國約有0.2億hm2鹽堿地，主要分布在西北、華北、東北內(nèi)陸和沿海地區(qū)[1]。在鹽堿土中，土壤滲透壓較大，土壤通氣性、透水性差，表層土壤養(yǎng)分有效性通常較低，因此鹽堿地區(qū)植物的生長和發(fā)育受到較大影響。據(jù)報(bào)道，我國華東沿海地區(qū)灘涂土壤表層剖面含鹽量以氯化物為主，整體含鹽量較高，超過常規(guī)綠化樹種的生長極限(低于0.3%)[2]。隨著沿海開發(fā)國家戰(zhàn)略的實(shí)施，鹽堿地區(qū)的植物綠化建設(shè)越來越受到重視。作為綠化建設(shè)的重要途徑，篩選適生的耐鹽綠化植物不僅能幫助人們科學(xué)地恢復(fù)植被，更能最大程度地發(fā)揮鹽堿地區(qū)的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。

海濱木槿(Hibiscushamabo)為木槿屬(Hibiscus)落葉樹種，樹高可達(dá)4～5 m，原產(chǎn)于浙江、福建和廣東沿海的部分地區(qū)。該樹種根系發(fā)達(dá)，具有耐鹽、抗風(fēng)和抗旱等特點(diǎn)。木槿(H.syriacus)同為木槿屬樹種，相比于海濱木槿，木槿因其較高的園藝觀賞、藥用和食用價(jià)值在熱帶和亞熱帶地區(qū)應(yīng)用頗為廣泛。在設(shè)施栽培中，通過異根嫁接可有效提高接穗的產(chǎn)量和品質(zhì)，如以葫蘆(Lagenariasiceraria)為砧木嫁接西瓜(Citrulluslanatus)可解決土壤鹽害導(dǎo)致的西瓜減產(chǎn)[3]；以南瓜(Cucurbitamoschata)為砧木嫁接黃瓜(C.sativus)可有效提高黃瓜的耐鹽性進(jìn)而提高產(chǎn)量[4]。已有研究表明，以海濱木槿為砧木對木槿進(jìn)行嫁接，嫁接親和力很強(qiáng)且植株生長良好[5]。因此，引種不同用途的木槿，并以海濱木槿為砧木進(jìn)行嫁接，同時(shí)開展耐鹽試驗(yàn)測定和容器育苗技術(shù)等研究，擴(kuò)大木槿適栽區(qū)域并形成規(guī)模化生產(chǎn)能力，能在很大程度上豐富沿海綠化的樹木種類及品種，為沿海產(chǎn)業(yè)帶生態(tài)環(huán)境建設(shè)提供必要的技術(shù)保障措施。

前期海濱木槿和嫁接木槿耐鹽試驗(yàn)在生長以及Na+、K+分布等方面已有研究[6-7]，因此本試驗(yàn)選擇海濱木槿并以海濱木槿為砧木的嫁接木槿，研究不同程度鹽脅迫下其光合、葉綠素?zé)晒?、?nèi)源激素、酶系統(tǒng)和養(yǎng)分等的變化，為進(jìn)一步研究嫁接木槿在鹽脅迫下的響應(yīng)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試海濱木槿和木槿來源于南京中山植物園試驗(yàn)苗圃，其中海濱木槿為一年生扦插苗，木槿枝條采自白花木槿(H.syriacus‘Notwood’)。2016年5月進(jìn)行木槿嫁接，砧木采用海濱木槿，每株海濱木槿上嫁接1個(gè)木槿插穗，栽培基質(zhì)由黃土、泥炭土、珍珠巖按體積比5 ∶1 ∶1混合而成，每盆(直徑25 cm、高度35 cm)1株，嫁接完成后將木槿嫁接苗與海濱木槿一起置于自然光照下并每周充分灌溉2次，前期適應(yīng)4個(gè)月。

2016年9月選取生長良好、長勢均勻的植株移放至溫室開始進(jìn)行NaCl脅迫處理。設(shè)置0(CK，自來水)、0.3%、0.5%、0.7% NaCl溶液澆灌基質(zhì)處理，每天16：00澆1次，每盆澆 100 mL。為防止NaCl脅迫下的應(yīng)激效應(yīng)，前3次澆灌先用各處理1/2濃度的對應(yīng)NaCl溶液澆灌，隨后正式開始試驗(yàn)，共連續(xù)澆灌30 d。試驗(yàn)采用隨機(jī)排列，每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.2 指標(biāo)測定

內(nèi)源激素脫落酸(ABA)和生長素(IAA)的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法。稱取0.5 g樣品用5 mL 80%甲醇提取，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，上清液過C18柱后取50 μL樣液，按照說明書進(jìn)行操作，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。參照湯章城的方法，抗壞血酸(ASA)含量采用草酸-EDTA(乙二胺四乙酸)比色法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑光還原法；過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外分光光度法[8]。

在第30天完成測定和采樣后，測定所有植株株高，然后收獲并分成莖和葉2部分，采用烘干法測定各部分干物質(zhì)質(zhì)量。株高相對生長率=(試驗(yàn)后株高-試驗(yàn)前株高)/試驗(yàn)前株高×100%。最后，采用H2SO4-H2O2法消煮，稱取粉碎的葉片干樣0.1 g，加入5 mL濃硫酸放置過夜后消煮，消煮液中全氮(TN)含量測定采用凱氏定氮法，全磷(TP)含量測定采用鉬銻抗比色法[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 19.0對海濱木槿以及嫁接木槿各個(gè)處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan’s法(P<0.05)進(jìn)行多重比較。作圖軟件采用Origin Pro 9.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下光合熒光的變化

NaCl脅迫第30天，海濱木槿和嫁接木槿都存活，但是不同濃度處理下的光合和熒光特性有所差異。從表1可以看出，0.3%、0.5% NaCl脅迫對于海濱木槿以及嫁接木槿的Pn、Gs、Tr并沒有明顯影響，但是在0.7% NaCl脅迫下，所有參數(shù)都顯著(P<0.05)降低。相對于海濱木槿，嫁接木槿的Pn在0.7% NaCl脅迫下被抑制程度大于海濱木槿，相比CK降低62.37%。因此，在0.5% NaCl脅迫下，海濱木槿和嫁接木槿均能有效維持葉片光合作用的功能，而在高濃度NaCl脅迫(0.7%)下2種植物的光合作用都受到抑制。

Fv/Fm值能反映植物的潛在最大光合能力，ΦPSⅡ同時(shí)反映在光照下PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉情況下的實(shí)際光化學(xué)效率。NaCl脅迫過程中植物Fv/Fm和ΦPSⅡ變化如表2所示。在鹽脅迫處理第30天，0.3%、0.5% NaCl脅迫下海濱木槿及嫁接木槿的Fv/Fm相比于CK均沒有顯著差異。而在 0.7% NaCl脅迫下，海濱木槿Fv/Fm、ΦPSⅡ相比于CK分別顯著降低12.5%、12.2%，嫁接木槿的Fv/Fm、ΦPSⅡ相比于CK分別顯著降低16.9%、10.5%。與Fv/Fm和ΦPSⅡ變化趨勢相反，在0.7% NaCl脅迫下海濱木槿、嫁接木槿的NPQ相比于CK分別顯著增加16.7%、11.1%。

表1 不同濃度NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿葉片光合參數(shù)變化

表2 不同濃度NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿葉片熒光參數(shù)變化

2.2 NaCl脅迫下葉片養(yǎng)分的變化

NaCl脅迫對海濱木槿和嫁接木槿葉片養(yǎng)分的影響見圖1。海濱木槿經(jīng)過近30 d的脅迫，相比于CK只有0.7% NaCl處理下TN含量顯著降低41.0%(P<0.05)。而嫁接木槿在 0.7% NaCl脅迫下，葉片TN、TP含量與CK相比分別降低30.2%、39.0%(P<0.05)。0.3% NaCl脅迫對2種植物的葉片TN和TP含量均沒有影響。

2.3 NaCl脅迫下內(nèi)源激素含量和抗氧化酶活性的變化

經(jīng)過近30 d的脅迫，嫁接木槿各個(gè)處理間的株高增長率并沒有表現(xiàn)出顯著差異，平均維持在2.6%，而海濱木槿平均增長率為1.9%，其中0.7% NaCl脅迫下的株高增長率顯著降低，僅為CK的68.2%(表3)，可見嫁接木槿在NaCl脅迫下生長速率并未受到較大影響，在生長方面有較大的耐鹽脅迫潛力。不同濃度NaCl脅迫對2種植物內(nèi)源激素含量的影響各不相同，總體看來，海濱木槿和嫁接木槿ABA含量隨著NaCl濃度的提高表現(xiàn)為上升趨勢，且在0.7% NaCl脅迫下顯著高于CK。IAA在海濱木槿內(nèi)的含量在0.3% NaCl脅迫時(shí)最低，為15.4 ng/g，在0.5% NaCl脅迫時(shí)最高，為 52.5 ng/g；在0.7% NaCl脅迫下IAA含量和CK持平。相反，IAA在嫁接木槿中的含量最高時(shí)為92.2 ng/g，此時(shí)的NaCl脅迫濃度為0.3%，而其余NaCl濃度下IAA含量均沒有顯著差異。

由表4可知，在0.3%、0.5% NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿葉片POD、CAT活性均沒有顯著變化，而在0.7%濃度下(除嫁接木槿CAT活性外)均顯著大于CK組，說明低濃度NaCl并未影響2種植物的抗氧化酶系統(tǒng)，而高濃度下2種植物的保護(hù)酶系統(tǒng)發(fā)揮作用，能較大程度清除細(xì)胞膜中的過氧化物質(zhì)。與SOD、POD和CAT不同，ASA是非酶促活性氧清除劑，在0.3%、0.5% NaCl處理時(shí)，ASA在2種植物內(nèi)的變化趨勢一致，與CK相比均顯著上升，不同的是，在0.7% NaCl脅迫下，海濱木槿ASA活性較CK增長78.5%(P<0.05)，而嫁接木槿較CK卻降低34.6%(P<0.05)。上述變化表明，在 0.3%、0.5% NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿葉片酶促抗氧化劑能保持穩(wěn)定，在0.7%NaCl脅迫下嫁接木槿酶活性變化與海濱木槿一致，酶活性升高抵御氧化脅迫，但是嫁接木槿在非酶促抗氧化系統(tǒng)方面，相比于海濱木槿還有待進(jìn)一步提升。

表3 不同濃度NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿內(nèi)源激素和株高增長率變化

表4 不同濃度NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿抗氧化酶活性與ASA含量的變化

2.4 氣孔導(dǎo)度與內(nèi)源激素含量的相關(guān)性分析

2種植物的Gs和ABA以及IAA含量的相關(guān)性分析如圖2所示。海濱木槿和嫁接木槿的Gs與ABA含量均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明氣孔導(dǎo)度隨著ABA含量的增加而減少。而Gs與IAA的相關(guān)分析表明，氣孔導(dǎo)度與IAA含量均沒有顯著相關(guān)性(圖2)。

3 討論與結(jié)論

植物的正常生長發(fā)育在鹽脅迫下受到影響，這種傷害作用在植物各種生理生化活動(dòng)中表現(xiàn)出來，其中最直觀的就是生長情況。在本試驗(yàn)中3個(gè)NaCl濃度下，脅迫第30天海濱木槿和嫁接木槿并沒有死亡，其中嫁接木槿的株高增長率平均維持在2.6%，而海濱木槿平均株高增長率為1.9%，可見嫁接木槿在NaCl脅迫下生長速率并未受到較大影響。王秀麗等的研究表明，在12月份落葉期，經(jīng)過400 mmol/L NaCl處理近30 d，海濱木槿存活率為100%，而木槿則全部死亡[10]。因此，本試驗(yàn)短期高濃度鹽脅迫表明，以海濱木槿為砧木嫁接木槿，木槿耐鹽性得到提高，這與蘆治國等的研究結(jié)果[6]一致。

光合是植物生長的基礎(chǔ)，耐鹽植物的主要特征之一就是在鹽脅迫下維持正常的Pn。但是植物的光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的活性在鹽脅迫下比較脆弱，是鹽脅迫影響植物光合作用的關(guān)鍵部位[11]。在正常生理狀態(tài)下，植物葉片葉綠素吸收的光能主要通過光合作用、葉綠素?zé)晒夂蜔岷纳?種途徑消耗掉，這3種途徑變化共同構(gòu)成了植物整個(gè)完整的光合系統(tǒng)。在0.3%、0.5% NaCl脅迫下，海濱木槿和嫁接木槿的Pn均保持在CK水平，同時(shí)最大光化學(xué)效率維持穩(wěn)定，可見光反應(yīng)中心的光能捕獲情況未受到影響。在0.7% NaCl脅迫下，嫁接木槿的Pn、Gs、Tr顯著降低，此時(shí)嫁接木槿氣孔關(guān)閉，蒸騰作用減緩，碳同化過程受到影響，最大光化學(xué)效率顯著降低，葉片類囊體中的三磷酸腺苷(ATP)和還原性輔酶(NADPH)等同化力在努力維持光合效率。此時(shí)2種植物的光合作用都受到抑制，同時(shí)植物熱耗散增加。2種植物的光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心部分關(guān)閉，上游電子傳遞情況受到阻礙。鹽脅迫下植物氣孔關(guān)閉的原因較多，一般認(rèn)為滲透脅迫可能引起水勢及氣孔導(dǎo)度降低，限制CO2同化。相關(guān)分析表明，NaCl脅迫下海濱木槿和嫁接木槿的氣孔開放程度與ABA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與IAA含量沒有顯著相關(guān)性。因此本試驗(yàn)中高濃度NaCl脅迫引起海濱木槿和嫁接木槿中的滲透脅迫，進(jìn)而導(dǎo)致氣孔部分關(guān)閉，植物內(nèi)源激素ABA與細(xì)胞上的激素受體結(jié)合，在細(xì)胞代謝和信號(hào)傳導(dǎo)層面發(fā)揮作用[12]。

在鹽堿土中，土壤基本理化性質(zhì)失衡導(dǎo)致植物所需的必要元素(N和P等)因淋溶或分配不均等原因流失，最后養(yǎng)分變得極其匱乏。不僅如此，大量的Na+、Cl-與NH4+、NO3-競爭，在造成離子毒性的同時(shí)也會(huì)造成養(yǎng)分短缺[13]。本研究表明，在0.7% NaCl脅迫下，海濱木槿和嫁接木槿葉片中的N和P濃度顯著降低，這一方面可能與高濃度NaCl澆灌導(dǎo)致盆中養(yǎng)分有效性顯著降低有關(guān)，另一方面在于植株維持光合能力將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能過程中消耗了ATP，而ATP的產(chǎn)生依賴于相關(guān)含N和P的合成酶[14]。0.3% NaCl脅迫對2種植物的葉片TN和TP含量均沒有影響，但是長期鹽脅迫下海濱木槿和嫁接木槿葉片養(yǎng)分濃度變化有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

除了降低養(yǎng)分的生物有效性，鹽脅迫也會(huì)激起植物體內(nèi)防御活性氧毒害的保護(hù)機(jī)制(酶促抗氧化保護(hù)系統(tǒng)和非酶促抗氧化保護(hù)系統(tǒng))，它們共同在清除氧自由基以及減少羥基自由基形成等方面起著重要作用[15]。有關(guān)鹽脅迫下SOD、POD、CAT在海濱木槿以及嫁接木槿中的表達(dá)已有報(bào)道[16-18]。耐鹽品種比鹽敏感品種具有較高的保護(hù)酶活性。本研究結(jié)果表明，在NaCl脅迫下，海濱木槿和嫁接木槿在抗氧化適應(yīng)性方面類似，通過保持相對較高的SOD、POD、CAT活性清除高濃度NaCl脅迫下活性氧，降低膜系統(tǒng)受害程度。ASA作為非酶促抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的重要組成部分，在0.3%、0.5% NaCl鹽脅迫下都顯著積累?？梢?，ASA與其他同工酶抗氧化劑共同調(diào)節(jié)著2種植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。但是在0.7% NaCl脅迫下，嫁接木槿葉片內(nèi)ASA活性顯著降低，表明海濱木槿非酶促抗氧化系統(tǒng)比嫁接木槿穩(wěn)定。ASA也是一些關(guān)鍵性酶的反應(yīng)底物，與植物內(nèi)源激素一起維持細(xì)胞正常的分裂和生長，在植物對環(huán)境脅迫響應(yīng)的過程中起著重要作用[19]。上述氣孔研究結(jié)果顯示，相比于IAA，ABA更能作為胞間信號(hào)從根系傳遞至葉片，開啟相關(guān)離子通道[20-22]，而相關(guān)的通路挖掘需要后續(xù)通過分子生物學(xué)研究證明。

綜上所述，海濱木槿和嫁接木槿都不同程度地受到NaCl脅迫的影響，尤其是在0.7%NaCl脅迫下，表現(xiàn)為植物葉片氣孔關(guān)閉，蒸騰作用降低，光合能力減弱，N和P的吸收受到一定影響。同時(shí)鹽脅迫也引發(fā)了植物體內(nèi)的非酶促抗氧化系統(tǒng)，并與內(nèi)源激素一起維持細(xì)胞內(nèi)生理生化活動(dòng)的穩(wěn)定?？傮w而言，以海濱木槿為砧木嫁接木槿可在一定程度上提高接穗的耐鹽性，嫁接木槿在株高增長率方面優(yōu)于海濱木槿。后續(xù)可以通過以不同抗性的海濱木槿為砧木，嫁接更多木槿栽培品種和變型，可進(jìn)一步豐富木槿的園藝觀賞、藥用和食用價(jià)值。