胡 波，薛 曼，李春寶，高 奉,，張 貞，申學振，張柏青，劉雨豐，鹿 鳴，劉玉杰解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 008；北京朝陽中西醫(yī)結(jié)合急診搶救中心 骨二科，北京 000；中國科學院化學研究所分子科學國家研究中心，北京 0090；中國科學院大學，北京 0009；國家體育總局運動醫(yī)學研究所，北京 0006

二次諧波是一種非線性光學效應，區(qū)別于光的反射、折射、衍射、干涉等線性光學效應。這種非線性光學效應是在激光問世之后才被科學家們發(fā)現(xiàn)并開始研究的。1961年，F(xiàn)ranken等[1]發(fā)現(xiàn)當激光器發(fā)射波長為694.3 nm的紅外激光穿過石英晶體時，除了紅外激光透射過晶體外，還能產(chǎn)生另一個波長為347.15 nm的紫外激光。Franken激光倍頻實驗首次實現(xiàn)了二次諧波(second harmonic generation)現(xiàn)象。在二次諧波的產(chǎn)生過程中，當激光強光照射到分子有序排列的石英晶體上，光波不再遵守線性疊加原理，而是與介質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生了非線性光學效應[2]。從此，關(guān)于非線性光學的研究迅速發(fā)展起來。經(jīng)過半個多世紀的發(fā)展，二次諧波技術(shù)實現(xiàn)了巨大的飛躍，特別是二次諧波成像技術(shù)，由于其獨特的高對比度、高分辨率等成像特點，已經(jīng)被迅速應用到生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，擁有巨大的應用前景。

1 諧波成像的條件與特點

一般認為，二次諧波信號的產(chǎn)生必須滿足三個條件：1)入射光強度必須足夠大，所以在激光誕生后才觀察到了二次諧波現(xiàn)象；2)介質(zhì)滿足相位匹配原則；3)介質(zhì)中具有非中心對稱結(jié)構(gòu)。由于在生物組織中，膠原、微絲、微管、細胞膜脂質(zhì)雙分子層等結(jié)構(gòu)都具有很好的二階非線性極化率和結(jié)構(gòu)非中心對稱性，因此能夠產(chǎn)生很強的二次諧波信號[3-5]。不僅如此，二次諧波成像還具有如下特點：1)二次諧波是生物組織的原發(fā)性信號，樣品無需染料標記，成像過程中沒有能量吸收，從根本上消除了對樣品的光致毒問題，成為一種非侵入性的成像方法，這與雙光子熒光成像有本質(zhì)的區(qū)別[3-4,6]；2)使用近紅外的激發(fā)光，在樣品中的穿透能力強，對樣品的損傷小，因此可以觀察比較厚的樣品，獲得深層次的成像；3)二次諧波成像的入射光波長與激發(fā)光波長相距較遠，信號不易互相干擾，提高了信噪比；4)在觀察較厚的組織標本時，二次諧波成像減少了非焦平面雜散光所產(chǎn)生的背景干擾，提高了三維空間分辨率，并進一步提高了信噪比[2-3,7-8]；5)由于沒有能量吸收過程，因此即使在焦平面上也沒有光毒性和光漂白性，這點也是區(qū)別于雙光子顯微鏡成像的最大優(yōu)勢[3,6]；6)二次諧波的產(chǎn)生是材料的二階非線性極化率所引起的，因此其信號可反映組織材料的某些結(jié)構(gòu)特性[9]；7)二次諧波對材料的結(jié)構(gòu)對稱性變化比較敏感，可為某些疾病的診斷和治療提供依據(jù)。正是基于以上特點，二次諧波成像技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用得以發(fā)展。

2 二次諧波成像技術(shù)在肌腱病研究中的應用

在生物組織中，膠原、微絲、微管、細胞膜脂質(zhì)雙分子層等結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生較強的二次諧波信號。因此，理論上各種組織都有利用二次諧波成像技術(shù)進行觀察的可能性。2010年，Olivier等[10]利用二次諧波成像和三次諧波成像，觀察了斑馬魚胚胎的有絲分裂全過程，記錄下斑馬魚受精卵從一個細胞到有絲分裂10次以后的二次諧波和三次諧波圖像，包括最深部細胞的有絲分裂紡錘體的形成和512個細胞階段的整體細胞團簇立體圖像，并記錄了每一級分裂的時間，精確到分鐘。這有力地證明了諧波成像技術(shù)的三維空間分辨率優(yōu)勢和無光毒性、光漂白性方面的安全性。2016年，Kuzmin等[11]利用背向二次諧波成像和三次諧波成像技術(shù)觀察了低分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤的大體病理標本，展示出腫瘤細胞與正常細胞在二次諧波成像下有更明顯的界線。原因是二次諧波信號的產(chǎn)生與生物組織的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)，因此可以發(fā)現(xiàn)更早期的腫瘤細胞內(nèi)蛋白分子結(jié)構(gòu)上的細微變化，同時也充分證明了背向諧波成像觀察活體、大體厚標本的優(yōu)勢。

肌腱組織主要成分是膠原纖維，肌腱病發(fā)病率很高。但是肌腱病的研究仍然有許多問題沒有解決，包括病理、疼痛機制、病因，甚至連術(shù)語都沒有得到統(tǒng)一[12-17]。因此肌腱組織也是二次諧波成像研究中的重要對象之一[18]。1971年Fine和Hansen[19]在膠原組織中首次檢測到二次諧波信號。2011年，Abraham等[20]通過對照大鼠跟腱的二次諧波成像和雙光子熒光成像，顯示二次諧波成像擁有更高的圖像分辨率和對比度。2012年，Abraham等[21]又分別利用前向、背向二次諧波成像技術(shù)對體外模擬環(huán)境下細胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原的重塑進行了三維成像定量分析，其中包括SHG信號衰減、纖維直徑、細胞尺寸、共定位輪廓、3D體積和傅立葉分析，證實了二次諧波信號與膠原結(jié)構(gòu)的強相關(guān)性。2014年，Bancelin等[22]利用二次諧波成像技術(shù)觀察鼠尾肌腱，并精確測得了其膠原纖維的直徑最小可達30 nm，指出二次諧波成像的分辨率比普通光學成像高15倍。2015年，Wen等[23]利用反射棱鏡使激光從兩個相互垂直的方向照射標本，對鼠尾肌腱纖維進行激發(fā)并進行二次諧波成像，證實膠原纖維的蛋白分子平行、定向的排列方式，當入射激光方向與纖維排列方向平行或垂直時，會產(chǎn)生不同強度的二次諧波信號，這一點與其他通過染色或熒光蛋白標記后的成像方式都不同，包括雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。作者認為普通二次諧波成像的三維圖像是靠計算機將多個焦平面的二維圖像疊加重建出來的，不是真正的三維圖像。而上述單一入射方向的激發(fā)光產(chǎn)生的二次諧波信號可能會因為入射激光方向與膠原排列方向垂直而無法產(chǎn)生較強的諧波信號，該現(xiàn)象容易導致判斷細胞外基質(zhì)中膠原蛋白的三維結(jié)構(gòu)時丟失重要信息，通過雙光子激發(fā)熒光顯微鏡進行對比驗證，為探索二次諧波成像特點及參數(shù)設置提供了重要依據(jù)。孫婭楠等[24]利用背向二次諧波成像和雙光子熒光成像技術(shù)觀察了人源膠原蛋白涂抹于小鼠表皮層后的透皮吸收程度，發(fā)現(xiàn)二次諧波成像可以更快速、更靈敏地檢測皮膚中的膠原纖維。Wu等[7]利用二次諧波成像三維空間高分辨率的特點，對跟腱的膠原纖維基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行了分析，明確了膠原纖維基質(zhì)的橫向、斜向連接對跟腱的生物力學的影響。2016年，Zhao等[25]設計了一個光纖探針，嘗試將激發(fā)光源和諧波信號采集通過光纖進行傳輸，并用這種裝置觀察了樹葉、魚鱗和鼠尾肌腱。雖然這種技術(shù)距離臨床應用還有很多問題，但將諧波成像技術(shù)從實驗室向臨床應用推進了一大步。Hase等[26]通過家兔肌腱離斷愈合的動物模型進行二次諧波觀察和力學測試，發(fā)現(xiàn)離斷肌腱部位膠原排列雜亂，與正常肌腱呈現(xiàn)出不同的二次諧波成像信號。并提出了采用所有像素點二次諧波信號強度的平均值和傅立葉變換的方法來對二次諧波成像進行量化分析。這種二次諧波信號強度和傅立葉變換的方法曾于2010年被Fung等[27]采用，用來分析疲勞載荷下肌腱的形態(tài)學變化。Hase等[26]將大體標本的二次諧波成像與實時生物力學測試相結(jié)合，進一步展示了二次諧波成像無需切片、染色，在新鮮標本上即可進行檢測的優(yōu)勢，提出了用光纖探針技術(shù)觀測活體標本，以及二次諧波成像運用于臨床的重要意義。但目前為止，在腱病動物模型的建立方面還缺少研究證據(jù)，需要進一步研究。

3 二次諧波成像技術(shù)的展望

諧波成像技術(shù)本身也在不斷完善和改進，在普通二次諧波成像技術(shù)的基礎上，衍生出了一系列新的成像技術(shù)，如快速干涉諧波成像[28-29]、調(diào)節(jié)偏振/消偏振二次諧波成像[9,30-31]等，均具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但二次諧波成像仍需要對以下因素進行最優(yōu)化考慮：1)脈沖激光器的輸出功率及其穩(wěn)定性；2)合適數(shù)值孔徑物鏡的選擇；3)高靈敏度探測器的選擇；4)不同脈沖激發(fā)波長的選擇；5)觀測樣品的選擇和制備方法(富含膠原、微絲、微管等具有高二階非線性和準相位匹配的樣本)[32]?？傊沃C波成像技術(shù)仍是一個尚未普及的、具有較高技術(shù)的新型檢測方法。該方法對樣本的要求簡單，但對儀器設備的操作、調(diào)試和維護要求非常專業(yè)。因此，二次諧波成像技術(shù)的發(fā)展和應用范圍的進一步拓展，需要生物醫(yī)學領(lǐng)域和物理化學領(lǐng)域更加緊密的合作。在腱病研究方面，高效、穩(wěn)定的動物模型的建立仍是當務之急，動物實驗控制上很難迫使所有的實驗動物達到過度使用的最低標準。如何選擇合適的模型動物及增加動物在運動過程中的依從性是自主運動建立過度使用性肌腱病動物模型的發(fā)展方向[33-35]。在此基礎上，才能利用二次諧波成像對生物組織結(jié)構(gòu)高度敏感的潛在優(yōu)勢，對腱病的發(fā)病機制做出深入研究，使其成為一種針對肌腱腱病的新型的、早期的、無創(chuàng)的診斷方法。