張穎聰，張 澤，于洪偉，桑卓琦，常 東

（1. 上海市浦東醫(yī)院 復旦大學附屬浦東醫(yī)院檢驗科，上海 201399；2. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院檢驗科，上海 201399）

腫瘤具有高死亡率、高轉(zhuǎn)移率和高復發(fā)率，是危害人類健康的重大疾病。診斷腫瘤的傳統(tǒng)方法有病理組織活檢、核磁共振成像（magnetic resonance imaging ，MRI）、電子計算機斷層掃描（computed tomography ，CT）、B超、X線胸片、內(nèi)鏡檢查等。這些檢查對于腫瘤早期的檢測效果十分有限，部分檢測方法不僅價格昂貴，且會給患者帶來痛苦。因此，在腫瘤早期階段開展快速、有效的檢測十分必要，不僅可以達到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的，還可以改善患者就醫(yī)體驗。腫瘤標志物的篩檢對于腫瘤早期檢測具有重要意義[1]。

腫瘤標志物是指由腫瘤組織或宿主與腫瘤相互作用所產(chǎn)生的一類活性物質(zhì)，能夠提示腫瘤存在與生長變化。腫瘤標志物常常存在于血清、細胞、尿液、體液或組織中，常見的有癌胚蛋白、腫瘤抗原、酶類標志物、激素、糖類抗原等。腫瘤標志物檢測具有操作便捷、標本易獲取、非侵入性、價格低廉、易于動態(tài)監(jiān)測疾病等優(yōu)點。腫瘤標志物的檢測對于腫瘤的預防、早期診斷與鑒別診斷、輔助腫瘤分類、疾病監(jiān)測、指導治療和預后判斷有重要作用，可有效彌補其他醫(yī)學技術(shù)對腫瘤診斷、治療及預后判斷的不足[2]。腫瘤標志物種類繁多，檢測方法也各異，本文將幾種常見腫瘤標志物檢測方法的研究進展作一綜述。

1 放射免疫分析

放射免疫分析是一種傳統(tǒng)的檢測腫瘤標志物的方法，是將放射性核素檢測技術(shù)與抗原抗體結(jié)合特異性的特點相結(jié)合，以定量微量物質(zhì)。放射免疫分析多使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易標記、衰變過程中釋放的射線易于被檢測等優(yōu)勢，逐漸替代了3H和14C而被廣泛使用。放射性核素標記具有高靈敏度、易于商品化等優(yōu)勢，曾被廣泛應(yīng)用，但與其他方法[3]相比，存在試劑盒使用壽命短、有放射性污染風險等缺點，目前已逐漸被其他檢測方法取代。

2 化學發(fā)光免疫分析

化學發(fā)光免疫分析是目前常用和較為成熟的腫瘤標志物檢測技術(shù)，其利用化學發(fā)光物質(zhì)作為標記物，根據(jù)發(fā)光信號的強度來判斷待測物質(zhì)的量。自1928年德國化學家Albrecht發(fā)現(xiàn)魯米諾的化學發(fā)光特性后，該檢測技術(shù)由于靈敏度高、快速、線性范圍廣、儀器結(jié)構(gòu)簡單、適合小型化、無放射性危害等優(yōu)點得到不斷發(fā)展[4-5]?；瘜W發(fā)光免疫分析為化學發(fā)光法，使用直接發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯 ）標記抗體，或使用酶類催化劑（如辣根過氧化物酶）[6]標記抗原抗體。將化學發(fā)光技術(shù)與微芯片電泳化學發(fā)光（microchip-electrophoresis chemiluminescence，MCE-CL）等技術(shù)聯(lián)合使用，具有效率高、分析快、自動化程度高、需要更少樣品和試劑的優(yōu)點[7-8]。

傳統(tǒng)化學免疫分析采用酶標技術(shù)，用辣根過氧化物酶催化魯米諾的免疫測定技術(shù)曾被廣泛使用，目前的免疫測定系統(tǒng)通常使用信號探針標記抗體并進一步測量目標分析物濃度。但這類天然酶具有穩(wěn)定性差、來源有限、對環(huán)境變化敏感、易受環(huán)境影響而變性等缺點，且標記過程通常會損害抗體分子的生物活性，因而基于金屬及金屬復合物[9-10]、磁性納米顆粒[11]、量子點[12]等催化發(fā)光底物的無酶免疫系統(tǒng)[13]不斷發(fā)展，將電化學技術(shù)和化學發(fā)光相結(jié)合檢測腫瘤標志物，兼具了化學發(fā)光的高靈敏度和電化學的時間、空間可控性[14-15]的優(yōu)點。有研究人員以CuS納米粒子作為過氧化物酶模擬物，設(shè)計了一種新型的無標記化學發(fā)光（chemiluminescence，CL）免疫方法測定甲胎蛋白，與基于酶標的CL免疫測定法相比，提出的無標記測定模式更簡單、價廉、快速。采用無標記的CL免疫測定法測定甲胎蛋白的線性范圍為0.1～60 ng / mL，檢出限為0.07 ng / mL，且此CL免疫測定系統(tǒng)顯示出良好的特異性、可接受的重復性和良好的準確性[16]。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗是一項臨床上已普及的檢測技術(shù)，這一技術(shù)將抗原或抗體包被于固相支持物上，將酶標抗原或抗體加入抗原抗體復合物中，通過底物使酶顯色來達到檢測目的。不同的研究人員會采用不同的酶聯(lián)免疫吸附試驗策略，如使用單克隆多克隆抗體[17]及嵌合抗體[18]來開發(fā)腫瘤標志物檢測試劑盒。酶聯(lián)免疫吸附試驗被開發(fā)后其檢測系統(tǒng)得到不同的優(yōu)化，如凝集素及生物素-親和素系統(tǒng)[19]在酶聯(lián)免疫吸附試驗中的應(yīng)用大大增強了其檢測的敏感性，熒光素酶夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗系統(tǒng)[20]也使檢測的敏感性不斷增強。酶聯(lián)免疫吸附試驗不僅適用于對單一分析物的測定，在多個分析物同時存在時，同樣具有良好的適用性[21]。

除酶聯(lián)免疫吸附試驗外，越來越多的研究集中于開發(fā)具有酶樣活性的模擬酶[22]。ZHANG等[23]以Cu2+作為助催化劑，利用Cu2+/Ag-AgI復合物作為催化劑具有在可見光下使3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）顏色產(chǎn)生變化的特性，構(gòu)建了夾心型比色法，通過監(jiān)測TMB溶液的顏色變化以定量癌胚抗原的水平，其開發(fā)的比色免疫測定在血清樣品分析中表現(xiàn)出良好的選擇性、重復性和穩(wěn)定性。

4 免疫傳感器

免疫傳感器一直備受腫瘤研究者關(guān)注和青睞。將特異性免疫反應(yīng)與生物傳感技術(shù)相結(jié)合形成的生物傳感器，其生物識別部分來自抗原與抗體的特異性識別和結(jié)合作用，通過理化換能器和信號放大裝置將生物信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栍糜跈z測。與其他幾種檢測方法相比，免疫傳感器具有靈敏度高、操作方便、設(shè)備簡單、成本低、可實現(xiàn)實時動態(tài)檢測等優(yōu)勢。目前，免疫傳感器大部分處于試驗階段，正向高通量、商品化發(fā)展，以滿足臨床大樣本檢測的要求，隨著技術(shù)的不斷成熟，有望成為腫瘤標志物的新型檢測手段。

金屬納米材料由于擁有獨特的光學、電子和催化特性常被用于構(gòu)建免疫傳感器[24-25]。LIU等[26]使用多孔鉑納米顆粒和PdPt納米籠同時測定腫瘤標志物癌胚抗原和甲胎蛋白，利用多孔鉑納米顆粒較大的表面積和較強的導電性，PdPt納米籠優(yōu)異的催化性能及高負載能力，增強和放大響應(yīng)信號，實現(xiàn)了對雙重分析物的靈敏測定。另外，使用納米合金材料制作的傳感器，與使用單一金屬材料相比具有更好的生物相容性，金屬之間良好的協(xié)同作用使傳感器催化性能進一步被放大。ZHANG等[27]使用PdPt納米顆粒，以石墨烯片和多壁碳納米管作為傳感平臺，組成納米復合物修飾電極，來測定腫瘤標志物潛伏膜蛋白-1，比單獨使用Pd納米粒子具有更高的過氧化物酶活性，PdPt凹面不僅可以提供較大的表面積，還可以提供更豐富的催化反應(yīng)活性位點。

碳納米材料，包括單壁碳納米管、多壁碳納米管、石墨烯、碳納米纖維、碳球等，由于其良好的力學性能、較高的化學穩(wěn)定性、特殊的電學性質(zhì)、優(yōu)異的機械性能和良好的導熱性被廣泛用于免疫傳感器的制造，制造的傳感器具有響應(yīng)速度快、電子傳遞速率高、負載量大、吸附性好、催化活性等優(yōu)點。LIANG等[28]研制了以雙層酶修飾碳納米管作為標記的夾心型免疫傳感器，利用層層自組裝技術(shù)將辣根過氧化物酶裝配到多壁碳納米管上，實現(xiàn)了信號放大，為臨床分析的超靈敏檢測提供了有力的支持。

聚合物復合材料由于良好的氧化還原性能，被作為免疫傳感器信號指示劑[29-30]。TANG等[31]用聚多巴胺-PB2+（PDA-Pb2 +）納米復合材料作為氧化還原體系，用殼聚糖 - 金納米復合材料涂覆電極，對癌胚抗原進行敏感性的電流分析。利用聚合物復合材料制作的免疫傳感器，因聚合物復合材料摻雜帶來的半導體或?qū)w性質(zhì)，其活性可被調(diào)節(jié)，摻雜/去摻雜的可逆過程使其可檢測不同的分析對象，擴大了檢測范圍。

免疫傳感器的制備除上述幾種材料外，還常引入其他具有不同功能的材料來提高性能。如利用量子點高表面活性、小尺寸及對光、電、溫度等敏感的特性，構(gòu)建的傳感器靈敏度較高[32-33]；利用磁性納米粒子的磁效應(yīng)構(gòu)建的傳感器抗干擾性好[34]；利用介孔材料良好的孔隙結(jié)構(gòu)和界面結(jié)構(gòu)構(gòu)建的傳感器，能夠保持酶良好的活性和功能性；利用水凝膠構(gòu)建的傳感器穩(wěn)定性好，水溶性高，能夠?qū)ν饨绱碳ぎa(chǎn)生響應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)變化[35]。此外，利用羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）納米顆粒，利用HAPNPs與鉬酸鹽的反應(yīng)檢測甲胎蛋白，構(gòu)建的傳感器選擇性好、靈敏度高，且成本低[36]。

5 蛋白組學

蛋白組學是近年來興起的腫瘤研究領(lǐng)域熱點之一，以蛋白質(zhì)為核心，對蛋白質(zhì)的表達模式和功能模式進行研究。蛋白組學技術(shù)具有高通量、微型化、自動化的優(yōu)勢，目前被廣泛用于臨床腫瘤學研究，為腫瘤標志物的研究提供了良好的平臺，但同時具有檢測成本昂貴、對技術(shù)人員操作要求高等缺點。

5.1 雙向電泳

雙向電泳是蛋白組學的經(jīng)典技術(shù)，是利用蛋白質(zhì)的等電點和不同相對分子質(zhì)量來分離蛋白質(zhì)的一門技術(shù)。雙向電泳是蛋白組學的核心技術(shù)之一，能夠通過染色強度得到蛋白質(zhì)翻譯后修飾的信息，能夠同時分離數(shù)千種蛋白質(zhì)。但其有不能分辨低拷貝數(shù)蛋白、檢測蛋白比估計總蛋白數(shù)少、耗時長、操作過程繁瑣等缺點，不能實現(xiàn)完全自動化，研究者常將其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用以分離、鑒定蛋白質(zhì)[37]，即將蛋白質(zhì)用雙向電泳分離后，運用質(zhì)譜技術(shù)進行逐一鑒定，這也成為蛋白組學研究的核心技術(shù)。相差凝膠電泳在雙向電泳的基礎(chǔ)上利用不同的染色對2個樣本進行標記，通量更高，提高了凝膠間的可比性，工作效率得到提升。

5.2 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)是將物質(zhì)離子化，根據(jù)不同質(zhì)荷比進行時間和空間的分離，進而獲得樣品的相對分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)等多種信息的分析方法。由于其具有高分辨力、高精度等特點被廣泛用于多個領(lǐng)域。近年來，常用色譜-質(zhì)譜技術(shù)，因其兼具了色譜的分離能力和質(zhì)譜的鑒定能力，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行準確、快速的分析和定量[39-40]?；|(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜是經(jīng)過改進的質(zhì)譜技術(shù)，前者利用基質(zhì)吸收激光的能量，得到肽質(zhì)量指紋譜，通過檢索數(shù)據(jù)庫以鑒定蛋白質(zhì)；后者利用電噴霧法，液相化多肽以鑒定蛋白質(zhì)。這2種方法能保證電離時樣品分子的完整性，不會使離子碎片化。

5.3 蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片是近十年來新興的分析技術(shù)，即在支持物表面排列蛋白質(zhì)探針以捕獲目標蛋白，再通過檢測器進行定性或定量分析。根據(jù)載體性質(zhì)不同，可分為固相蛋白質(zhì)芯片和液相蛋白質(zhì)芯片，臨床上常用來篩選和尋找腫瘤標志物。反相蛋白質(zhì)芯片也是蛋白組學高通量方法[41]。蛋白質(zhì)芯片不僅可用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，還可研究蛋白質(zhì)與核苷酸間的相互作用，具有通量高、速度快、靈敏度高的優(yōu)點。DUAN等[42]設(shè)計了一種蛋白質(zhì)芯片，使用膠體納米金標記葡萄球菌屬蛋白A作為指標，應(yīng)用免疫金銀染色增強技術(shù)擴增檢測信號，此蛋白質(zhì)芯片可在不存在交叉反應(yīng)的情況下檢測乙型肝炎病毒抗體和丙型肝炎病毒抗體，并可在40 min內(nèi)提供結(jié)果，速度相對酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法更快。YANG等[43]開發(fā)了一種微陣列芯片，首次使用硅和水凝膠作為微陣列的載體，構(gòu)成的芯片具有二氧化硅和水凝膠兩者的優(yōu)點。

5.4 表面增強激光解析及電離飛行時間質(zhì)譜

表面增強激光解析及電離飛行時間質(zhì)譜是將質(zhì)譜與蛋白質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，能夠檢測到其他傳統(tǒng)方法檢測不到的蛋白質(zhì)，只需少量樣品，檢測時間短且重復性高，可分析復雜樣品。該技術(shù)基于特殊芯片的表明增強吸附作用，將樣品蛋白質(zhì)吸附到芯片上后，將結(jié)合蛋白質(zhì)解離成核電離子以繪制質(zhì)譜圖。將健康人與腫瘤患者的蛋白圖譜進行比較，能夠發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)。JIN等[44]開發(fā)了一種對糖類抗原19-9正常的胰腺癌患者與健康或良性個體進行診斷和鑒別診斷的方法，使用與CM10芯片聯(lián)合的表面增強激光解吸及電離飛行時間質(zhì)譜分析相關(guān)樣品，生成了具有不同蛋白質(zhì)的診斷模型。

6 分子生物學方法

檢測腫瘤標志物的分子生物學方法包括聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization， FISH）、逆轉(zhuǎn)錄PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 （single-strand conformation polymorphism，SSCP）、多種測序技術(shù)等。分子生物學技術(shù)具有高通量，特異性強、敏感性高等優(yōu)勢，但也存在價格昂貴、檢測周期長等缺點。

PCR是目前被廣泛使用的一種簡單、敏感、高效、特異和快速的，能在體外擴增DNA的技術(shù)。由經(jīng)典PCR衍生出的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤標志物的檢測，如逆轉(zhuǎn)錄PCR被用于口咽癌[45]、結(jié)直腸癌[46]、前列腺癌[47]、肺癌[48]等多種腫瘤的檢測。甲基化特異性PCR是一種檢測特異位點甲基化的技術(shù)[49]，檢測DNA甲基化敏感性極高，KOIKE等[50]發(fā)現(xiàn)甲基化特異性PCR對于胃癌標志物的檢出率高于逆轉(zhuǎn)錄PCR。此外，多種PCR衍生技術(shù)如擴增融合PCR、實時熒光定量PCR等也被運用于腫瘤標志物的檢測。

FISH以標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，根據(jù)核酸堿基配對原理，將標記的探針與單鏈核酸片段配對，在熒光顯微鏡下觀察目標序列的分布。FISH雖屬于低通量檢測，但目前已被用于檢測腫瘤細胞[51]、突變?nèi)旧w[52]、染色體重排[53]，在腫瘤生物標志物檢測和個體化醫(yī)療方面具有重要意義。

7 液體活檢

液體活檢是一種從血液等非實性樣本中取樣，用于診斷和檢測腫瘤的方法。液體活檢技術(shù)主要包括循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）檢測、循環(huán)腫瘤DNA （circulating tumor DNA， ctDNA）檢測、外泌體檢測等。與組織活檢相比，液體活檢能夠早期篩查、檢測腫瘤標志物，克服了腫瘤的時空異質(zhì)性，具有無創(chuàng)、易反復取樣、操作簡便、可實時監(jiān)控等優(yōu)點，但同時也有價格昂貴、檢測標準不統(tǒng)一等缺點。CTC檢測目前主要使用的是免疫細胞化學方法，但CTC極低的豐度及其異質(zhì)性使其面臨著技術(shù)挑戰(zhàn)。ctDNA檢測主要采用分子生物學方法，但ct DNA具有易降解、含量低等缺點，為精準檢測帶來困難。外泌體檢測在腫瘤診斷方面顯示出良好的應(yīng)用前景，是具有發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方法，但其提取及操作尚無統(tǒng)一流程，檢測系統(tǒng)有待進一步完善，以滿足臨床大規(guī)模樣本檢測的需要。

8 總結(jié)

腫瘤標志物作為臨床上腫瘤輔助診斷、治療參考以及預后判斷的重要指標，目前在應(yīng)用上愈發(fā)廣泛，臨床對檢測技術(shù)的要求也不斷發(fā)展。不僅有大量靈敏度或特異性更高的標志物被發(fā)現(xiàn)，而且在檢測方法上也緊跟臨床工作需求而不斷發(fā)展。不同檢測方法均有其優(yōu)勢與不足，如何對不同方法進行整合，提高腫瘤標志物的檢出能力，是研究者們需關(guān)注和探索的問題。能夠在腫瘤早期檢出低含量腫瘤標志物，永遠是臨床腫瘤診斷的主要需求。不管使用何種材料，使用何種方法，提高檢測的敏感性和特異性及穩(wěn)定性永遠是腫瘤標志物研發(fā)所追求的目標。