鄧 慧, 張麗琳,黎瑞巧, 張 蕾, 黃金海

(天津大學生命科學學院，天津 300072)

CpG ODNs寡聚脫氧核苷酸(CpG oligodeoxy-nucleotieds,CpG ODNs)是含胞嘧啶和鳥嘌呤的二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸。大量研究證實，含有未甲基化CpG基序的細菌DNA或人工合成的寡聚脫氧核苷酸是一種強大的免疫激動劑。CpG ODNs能夠直接激活pDC和B細胞，從而引發(fā)先天性和適應性免疫應答[1]。由CpG ODNs引發(fā)的級聯(lián)反應能夠間接誘導NK細胞、單核細胞、T細胞和巨噬細胞的成熟分化和增殖[2-6]。TLR9的激活可誘導B細胞產(chǎn)生IL-6、IL-12和趨化因子CXC并誘導B細胞表達IgM[7-9]。被CpG ODNs激活的B細胞可上調(diào)表達Fc的表達受體(FcR)和共刺激分子MHC Ⅱ類分子(CD40、CD80、CD86)[10-11]。CpG ODNs刺激的B細胞增殖并分化為漿細胞和記憶B細胞[12]。CpG ODNs作為免疫增強劑和疫苗佐劑一開始主要以小鼠和人為研究模型，2001年，Kamstrup S等[13]首次研究了CpG ODNs對豬PBMCs刺激的作用以及篩選出最適合豬的特異性基序ATCGAT。有研究表明，使用CpG ODNs作為免疫佐劑，可以增強仔豬對豬鏈球菌敗血癥疫苗(SSSK疫苗)的免疫應答，包括增強SSSK疫苗的特異性抗體滴度、淋巴細胞增殖，增強PBMCs上IFN-γ、IL-6、MHCⅡ和CD14的表達[14]。

為了篩選出能有效激活豬免疫系統(tǒng)的CpG ODNs的序列，設(shè)計并合成了7種引物[13]，包含CpG的寡聚核苷酸，并用其刺激豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)、豬肺泡巨噬細胞(3D4/21)和豬外周血單核細胞(PBMCs)，檢測3種細胞中多種細胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化，同時還檢測了經(jīng)CpG ODNs處理后的IPEC-J2中病毒增殖的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CpG ODNs的設(shè)計與合成 總結(jié)人與小鼠的CpG ODNs的特征，結(jié)合最適合豬的CpG基序ATCGAT共設(shè)計合成了7條包含CpG單元的序列(部分硫代修飾)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

1.1.2 細胞及病毒 豬腸道上皮細胞系(IPEC-J2)，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；外周血單核細胞(PBMCs)，天津大學生命科學學院微生物與免疫實驗室分離自天津市寧河原種豬場的豬；豬肺泡巨噬細胞(3D4/21)，中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院病毒室惠贈；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)及水皰性口炎病毒(VSV)-GFP，天津大學生命科學學院微生物與免疫實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 淋巴細胞分離液，天津灝洋生物制劑有限公司產(chǎn)品；RMPI-1640與H-DMEM完全培養(yǎng)液，Gibico公司產(chǎn)品；胎牛血清(FCS)，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Poly(I:C)，北京達科為生物有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，南京諾唯贊生物公司產(chǎn)品；Tran Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix第一鏈合成試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Trizol LS reagent、DEPC，Invitrogen公司產(chǎn)品。

表1 CpG ODNs序列及能量

*代表硫代磷酸二酯鍵；下劃線代表CpG單元。

*Phosphorothioate backbone;CpG motif marked with underline.

1.1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱和生物安全柜，美國Thermo fisher公司產(chǎn)品；實時熒光定量PCR儀(ABI 7500)、倒置熒光顯微鏡(型號 IX73)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 外周血單核細胞的分離及培養(yǎng) 無菌采集豬全血與EDTA抗凝劑按4∶1加入到50 mL離心管，淋巴細胞分離按說明書分離。IPEC-J2細胞與3D4/21細胞的培養(yǎng)與計數(shù)同PBMCs，IPEC-J2細胞使用100 mL/L FCS-H-DMEM培養(yǎng)，PBMCs與3D4/21細胞使用100 mL/L FCS-RMPI 1640培養(yǎng)。活細胞計數(shù)按照細胞濃度1×106個/mL每孔2 mL鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

1.2.2 CpG ODNs體外刺激試驗 按照7個試驗組(CpG1、CpG6-CpG11)、陽性對照組(Poly(I:C))、陰性對照(non-CG序列)、空白對照設(shè)置培養(yǎng)孔，每個試驗組均設(shè)3組重復。待細胞生長穩(wěn)定后進行體外刺激試驗。試驗組、陽性對照、陰性對照刺激終濃度均為10 μg/mL，等體積PBS刺激作為空白對照。同時置于37℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后提取總RNA，并合成cDNA。RNA的提取操作按照Invitrogen公司Trizol提取試劑盒說明進行，cDNA以提取的總RNA為模板，合成按照Trans Script First-strand cDNA Synthesis Super Mix說明操作。

1.2.3 熒光定量PCR檢測細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

1.2.3.1 檢測引物設(shè)計 參照NCBI/GenBank登錄的基因用DNA Man軟件分析其序列保守區(qū)，Oligo 7.0軟件分別在其保守區(qū)內(nèi)設(shè)計熒光定量PCR檢測引物，由北京金維智公司合成(表2～表6)。

表2 豬TLR分子相對熒光定量PCR引物

表3 豬TLR信號通路分子相對熒光定量PCR引物

表4 豬白細胞介素相對熒光定量PCR引物

表5 豬腫瘤壞死因子和干擾素相對熒光定量PCR引物

1.2.3.2 實時熒光定量PCR 按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書，建立20 μL實時熒光定量PCR反應體系，退火溫度按照引物的最適退火溫度減少2℃操作。real-time qPCR反應體系：2×Trans Start Top Green qPCR Super Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板 2 μL，Passive reference Dye(50×) 0.4 μL，去離子水6.8 μL。real-time qPCR反應程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，Tm降低2℃ 30 s，70℃ 20 s，共45個循環(huán)；60℃～95℃，熔解曲線分析。

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理 采用相對熒光定量2-ΔΔCT法進行相對定量分析(ΔΔCT =(Cttarget x-Ctβ-actin)sample-(Cttarget x-Ctβ-actin)control)，值采用Graph Pad Prism統(tǒng)計軟件進行Student's t test分析，取轉(zhuǎn)錄水平的平均值作雷達圖模型取值。CpG ODNs的能量分析使用Chem 3D 15.0軟件分析。

1.2.4 PEDV在IPEC-J2上標準曲線的建立 將500 μL毒液中加入1 mL Trizol Reagent震蕩搖勻，按1.2.2提取RNA并合成cDNA，擴增PEDV M基因，引物序列見表7。50 μL反應體系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，上、下游引物(25 pmol/μL)各1 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 36.5 μL。PCR反應程序：94℃ 5 min；53℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

表6 豬抗原遞呈相關(guān)分子相對熒光定量PCR引物

表7 豬PEDV M基因克隆及相對熒光定量PCR引物

取35 μL PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，利用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化回收，操作按試劑盒說明進行。PCR產(chǎn)物與pUM19-T載體的連接，10 μL反應體系：Pum19-T Easy(50 μg/μL) 0.5 μL，膠回收目的片段 3 μL，10×T4連接酶buffer 1 μL，T4 DNA 連接酶 1 μL，ddH2O 4.5 μL。16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化到DH-5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選菌株并擴大培養(yǎng)。小提質(zhì)粒使用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I試劑盒，操作按說明書進行。用Nanodrop測定重組質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)計算公式換算成拷貝數(shù)。

108～10310倍梯度稀釋，real-time PCR反應體系和程序同1.2.3.2，以每個濃度對應的CT值做標準曲線，計算標準曲線的R2。

1.2.5 不同CpG ODNs對PEDV在IPEC-J2上增殖的影響 將IPEC-J2調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL，鋪于6孔細胞培養(yǎng)板中。按照7個試驗組(CpG1、CpG6-CpG11)、陽性對照組(Poly(I:C))、陰性對照孔、空白對照設(shè)置培養(yǎng)孔，并設(shè)立3組重復試驗。試驗組加CpG ODNs、陽性對照加入Poly(I:C)、刺激終濃度均為10 μg/mL，陰性對照和空白對照孔加入等體積的PBS。同時置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，棄培養(yǎng)基，在試驗組、陽性對照組與陰性對照組接種10 MOI PEDV，空白對照組不接種PEDV，只加入與試驗組等量的培養(yǎng)基，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，按照1.2.2提取總RNA并合成cDNA。以此為模板，進行熒光定量PCR擴增，將得到的CT值帶入標準曲線中，計算不同組的病毒載量。

1.2.6 不同CpG ODNs對VSV-GFP在IPEC-J2上增殖的影響 試驗組和對照組的設(shè)置與CpG ODNs處理細胞的方法均按照1.2.5，處理細胞6 h后每孔接0.1 MOI VSV-GFP，24 h后清洗3次，DAPI染色10 min，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，以綠色熒光強度判斷VSV-GFP的增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 CpG ODNs對TLR9、TLR3、TLR8和TLR9的影響

CpG ODNs在IPEC-J2細胞上主要促進TLR9和TLR3兩種TLRs轉(zhuǎn)錄水平升高，其中除CpG7外，其余CpG ODNs均能促進TLR9的轉(zhuǎn)錄水平升高，其中以CpG1和CpG11的促進作用最明顯，CpG7可以促進TLR3轉(zhuǎn)錄水平的升高。除CpG1和CpG10，其余CpG ODNs可以促進TLR3轉(zhuǎn)錄水平升高。CpG ODNs不能促進TLR7的轉(zhuǎn)錄水平升高，并且抑制TLR8的轉(zhuǎn)錄。CpG1和CpG11能夠使3D4/21細胞上TLR3和TLR9的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(圖1)。

2.2 CpG ODNs對MyD88、NF-κB、p38和IRF3的影響

在IPEC-J2上，CpG ODNs促進IPEC-J2細胞MyD88和NF-κB轉(zhuǎn)錄水平升高，CpG8和CpG10能夠促進p38的轉(zhuǎn)錄水平升高，雖然有多種CpG ODNs能夠促進TLR3的轉(zhuǎn)錄，但是普遍不能使IRF3的轉(zhuǎn)錄水平升高，只有CpG10和CpG11能夠在PBMCs上促進IRF3的轉(zhuǎn)錄水平升高(圖2)。

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖1 TLR3、TLR7、TLR8和TLR9在3種細胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.1 The relative expressions of TLR3，TLR7，TLR8 and TLR9 in different CpG ODNs treatment cells

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖2 MyD88、NF-κB、p38和IRF3在3種細胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.2 The relative expressions of MyD88，NF-κB，p38 and IRF3 in different CpG treatment cells

2.3 CpG ODNs對白細胞介素的影響

CpG ODNs能夠促進IPEC-J2上IL-2轉(zhuǎn)錄水平的升高，在PBMCs上,能夠促進IL-4轉(zhuǎn)錄水平升高，在3D4/21細胞上,CpG ODNs能促進多種白介素轉(zhuǎn)錄水平升高，CpG1和CpG11能夠促進IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17的轉(zhuǎn)錄水平升高，CpG7和CpG10也能夠促進上述白介素轉(zhuǎn)錄水平升高，但是促進作用不如CpG1和CpG11顯著(圖3)。

2.4 CpG ODNs對IFN-α和IFN-β的影響

CpG ODNs能夠促進IPEC-J2上TNF-α的高效轉(zhuǎn)錄，但是對干擾素的促進作用較弱，CpG1、CpG11、CpG7和CpG10能夠促進3D4/21細胞上TNF-α、IFN-α和IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平升高。在PBMCs上CpG ODNs能夠促進IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平升高(圖4)。

2.5 CpG ODNs對抗原遞呈相關(guān)分子的影響

在IPEC-J2上CpG ODNs對抗原遞呈相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄的促進作用較差，只有CpG10能夠促進MHCⅡ的轉(zhuǎn)錄，在3D4/21細胞和PBMCs上，CpG ODNs能夠強烈促進CD86轉(zhuǎn)錄，并且CpG10和CpG11能夠在3D4/21細胞上促進MHCⅡ的轉(zhuǎn)錄(圖5)。

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖3白細胞介素在3種細胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.3 The relative expressions of the interleukin in different CpG ODNs treatment cells

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖4干擾素和腫瘤壞死因子在3種細胞上轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.4 The relative expressions of the interferon and anti-tumor necrosis factor in different CpG ODNs treatment cells

A.IPEC-J2 cells;B.3D4/21;C.PBMCs

圖5 MHCⅠ、MHCⅡ和CD86在3種細胞轉(zhuǎn)錄水平的變化

Fig.5 The relative expressions of major histocompatibility complexes and adhesion molecules in different CpG ODNs treatment cells

2.6 CpG ODNs對VSV-GFP在IPEC-J2細胞上增殖的影響

根據(jù)1.2.4得到PEDV標準曲線，R2=0.985 8的線性回歸方程y=-3.167x+36.86,將1.2.5得到的Ct值帶入y中，即得到PEDV的M基因的拷貝數(shù)(即x的值)(圖6)經(jīng)CpG ODNs處理后的IPEC-J2感染PEDV后可顯著降低PEDV在細胞上的增殖，其中CpG1抵抗PEDV能力最強，經(jīng)CpG ODNs處理后的IPEC-J2也可以明顯觀察到細胞中綠色熒光數(shù)量少于空白對照組和陰性對照組，說明CpG ODNs也能夠降低VSV-GFP在細胞上增殖(圖7和圖8)。

圖6 PEDV在IPEC-J2增殖標準曲線

圖7 不同CpG ODNs對PEDV在IPEC-J2增殖的影響

圖8 VSV-GFP在經(jīng)CpG ODN處理IPEC-J2細胞的增殖

3 討論

通過查閱總結(jié)文獻設(shè)計并合成了7條具有不同特征的CpG ODNs,對7條CpG ODNs在體外對3種豬源細胞(IPEC-J2細胞，3D4/21細胞，PBMCs)上免疫分子的轉(zhuǎn)錄水平的影響進行了評價，包括胞內(nèi)TLRs、TLRs相關(guān)信號通路分子、白細胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子、抗原遞呈相關(guān)分子等。最后還探究了CpG ODNs處理過IPEC-J2的抗病毒能力的變化。本研究選取了2種單鏈RNA病毒PEDV和VSV，比較了經(jīng)過CpG ODNs處理過的細胞的抗病毒的能力。

檢測了CpG ODNs處理的3種豬源細胞免疫應答相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平變化。表明CpG ODNs可以促進IPEC-J2上TLR3和TLR9轉(zhuǎn)錄水平的升高。雖然CpG ODNs促進3D4/21細胞和PBMCs的TLRs及信號通路分子的轉(zhuǎn)錄升高，作用不及IPEC-J2，但是這并不妨礙3D4/21和PBMCs下游的細胞因子轉(zhuǎn)錄水平升高，這可能說明CpG ODNs在3種細胞上的作用時間不同，CpG ODNs可以在IPEC-J2上作用更長的時間。CpG ODNs可調(diào)節(jié)細胞的免疫應答類型，平衡Th1/Th2反應：CpG1、CpG7、CpG9、CpG10和CpG11可以促進多種Th類型細胞因子的轉(zhuǎn)錄(如Th2型細胞因子IL-4、Th1型細胞因子IL-12和IFN-γ、局部炎性因子IL-17等)；CpG6和CpG8能夠平衡Th1/Th2反應，同時促進Th1型細胞因子IFN-γ和/或IL-12的轉(zhuǎn)錄水平升高。CpG ODNs也能夠促進抗原遞呈能力的增強，CpG ODNs在3D4/21和PBMCs上促進了黏附分子CD86轉(zhuǎn)錄水平的升高，提高了APC對誘導T淋巴細胞增殖及產(chǎn)生IL-2的能力。并且CpG ODNs對3種細胞的MHC分子的轉(zhuǎn)錄也有促進作用。CpG ODNs能夠促進PBMCs細胞上干擾素的轉(zhuǎn)錄，PBMCs上IFN-γ和IFN-β相比于IPEC-J2細胞和3D4/21細胞的轉(zhuǎn)錄水平更高。CpG ODNs對不同細胞免疫分子轉(zhuǎn)錄的促進作用的能力也有較大的差別，例如CpG7促進IPEC-J2細胞的免疫分子轉(zhuǎn)錄較差，但是對促進3D4/21細胞的免疫分子轉(zhuǎn)錄較強，因此CpG7更加適用于需要提高APC的抗原遞能力的疫苗，而CpG11對3種細胞免疫分子轉(zhuǎn)錄的促進作用都比較強；CpG1能夠促進3D4/21細胞表達多種白介素，可以使APC促進多種T細胞的活化。

3種豬源細胞對CpG ODNs免疫應答反應不同。IPEC-J2細胞作為腸上皮細胞是機體的屏障并且是先天免疫反應發(fā)生地，3D4/21細胞是先天免疫細胞并且可在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮APC的作用，在豬小腸上皮細胞上促進TLR9和/或TLR3的轉(zhuǎn)錄水平的效果更為明顯，說明CpG ODNs可較好地激活天然免疫反應，增強黏膜免疫應答。CpG ODNs作為佐劑可促進3D4/21細胞的抗原遞呈能力及協(xié)助T細胞的激活。CpG ODNs可直接促進PBMCs產(chǎn)生干擾素，增強抗感染能力。

不同CpG ODNs對病毒增殖的抑制作用因病毒而異。CpG ODNs處理細胞顯著抑制了PEDV的增殖(P<0.01)，其能力排序為CpG1> CpG7> CpG6>CpG10> CpG11> CpG9> CpG8。CpG1最接近天然的CpG ODNs結(jié)構(gòu)且能量最高，擁有最好的抗病能力。CpG ODNs處理細胞對VSV增殖的抑制作用為CpG11> CpG6> CpG10> CpG8> CpG7> CpG9> CpG1。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了CpG ODNs能夠促進TLR9或TLR3、及其信號通路分子的轉(zhuǎn)錄，引發(fā)B細胞活化，通過改變細胞因子譜的表達調(diào)節(jié)Th細胞的反應類型，可以促進APC的抗原遞呈能力。因此可通過選擇不同型CpG ODNs作為佐劑，根據(jù)疫苗免疫應答特點，以強化體液免疫或局部黏膜免疫；特定型CpG ODNs也可作為潛在干擾素誘生劑，用于PEDV或VSV感染的防控。

[1] Hartmann G,Krieg A M.Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells[J].J Immunol,2000,164(2):944-953.

[2] Ballas Z K,Rasmussen W L,Krieg A M.Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA[J].J Immunol,1996,157(5):1840-1845.

[3] Klinman D M,Yi A K,Beaucage S L,et al.CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6,interleukin 12,and interferon gamma[J].Proc Nat Acad Sci U S A,1996,93(7):2879-2883.

[4] Sun S,Zhang X,Tough D F,et al.Type I interferon-mediated stimulation of T cells by CpG DNA[J].J Exp Med,1998,188(12):2335-2342.

[5] StaceyY K J,Sweet M J,Hume D A.Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA[J].J Immunol,1996,157(5):2116-2122.

[6] Roman M,Martin-orozco E,Goodman J S,et al.Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants[J].Nat Med,1997,3(8):849-854.

[7] Krieg A M,Yi A K,Matson S,et al.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation[J].Nature,1995,374(6522):546-549.

[8] Kato A,Ogasawara T,Homma T,et al.CpG oligodeoxynucleotides directly induce CXCR3 chemokines in human B cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,320(4):1139-1147.

[9] Yi A K,Klinman D M,Martin T L,et al.Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA.Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway[J].J Immunol,1996,157(12):5394-5402.

[10] Davis H L,Weeratna R,Waldschmidt T J,et al.CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen[J].J Immunol,1998,160(2):870-876.

[11] Kobayashi H,Horner A A,Takabayashi K,et al.Immunostimulatory DNA pre-priming: a novel approach for prolonged Th1-biased immunity[J].Cell Immunol,1999,198(1):69-75.

[12] Jung J,Yi A K,Zhang X,et al.Distinct response of human B cell subpopulations in recognition of an innate immune signal, CpG DNA[J].J Immunol,,2002,169(5):2368-2373.

[13] Kamstrup S,Verthelyi D,Klinman D M.Response of porcine peripheral blood mononuclear cells to CpG-containing oligodeoxynucleotides[J].Vet Microbiol,2001,78(4):353-362.

[14] Hartmann G,Marschner A,Viveros P R,et al.CpG oligodinucleotides induce strong humoral and cellular responses to swine streptococcic septicemia vaccine in pigletsinvivo[J].Int Immunopharmacol,2006,6(3):342-350.