岳曉禹，張 華，陳威風(fēng)，鄒 建，李 欣，楊 娜

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

玉米是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要糧食作物和儲糧品種之一。玉米在儲藏過程中容易發(fā)生霉菌污染，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。霉菌污染不僅會導(dǎo)致儲糧的顏色、味道、營養(yǎng)成分發(fā)生改變，食用價值降低，更會產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素等多種真菌毒素，對食用者造成急性或者慢性的毒性危害，導(dǎo)致肝炎、肝癌等嚴(yán)重危害人體健康的疾病[1-2]。研究儲糧中霉菌污染的發(fā)生規(guī)律，從而減少儲糧霉菌污染，是提高我國糧食安全和食品安全的重要研究領(lǐng)域。

由于真菌毒素危害的嚴(yán)重性，多數(shù)研究者將關(guān)注點(diǎn)放在真菌毒素上，如對糧食中真菌毒素的污染現(xiàn)狀及分布規(guī)律進(jìn)行調(diào)查分析[3]、真菌毒素檢測方法的建立[4-5]、真菌毒素脫毒方法的開發(fā)[6-7]等，而忽視了對霉菌群落本身的研究。霉菌與真菌毒素并非一一對應(yīng)，一種霉菌可以產(chǎn)生多種毒素，而一種毒素也可能由多種霉菌產(chǎn)生，因此，并不能從儲糧中毒素的分布來推測儲糧中霉菌的種類。真菌毒素是霉菌的次級代謝產(chǎn)物，霉菌是真菌毒素的源頭，研究糧食儲存條件與霉菌群落之間的關(guān)系，根據(jù)實(shí)測數(shù)據(jù)建立儲糧霉菌污染預(yù)測模型[8]，從而采取相應(yīng)措施減少霉菌污染，可以從根源上降低糧食中真菌毒素的含量。

目前我國關(guān)于糧食儲存條件與霉菌群落組成之間的研究多數(shù)采用培養(yǎng)法進(jìn)行，如鐘雪美等[9]利用平板培養(yǎng)法研究了不同儲糧方式的霉菌動態(tài)變化和空間格局變化；李聽聽等[10]通過培養(yǎng)分離鑒定法研究了玉米初始水分及相對濕度對儲糧中霉菌群落的影響；吳紅萍等[11]采用稀釋涂布平板法和Biolog鑒定系統(tǒng)結(jié)合分析了海南省各市縣儲糧谷物霉菌菌相分布。在研究霉菌群落特征時，雖然培養(yǎng)法有利于霉菌菌種的鑒定，但也存在靈敏度低、誤差大等缺點(diǎn)[12]。

在微生物群落研究中，分子生物學(xué)技術(shù)如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等具有的巨大優(yōu)勢。DGGE技術(shù)的原理為序列不同的DNA分子在變性劑梯度變化的凝膠中因解鏈程度不同而獲得不同的電泳遷移速率，因此可以通過DGGE將長度相同但序列不同的DNA進(jìn)行分離[13]。利用通用引物擴(kuò)增微生物特定DNA片段，再通過DGGE技術(shù)將其分離，即可獲得樣品中微生物群落的指紋圖譜。DGGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品儲藏中細(xì)菌群落的變化，如鯽魚儲藏過程中[14]、真空包裝冷卻鹿肉儲藏過程中[15]、及生鮮南美白對蝦儲藏過程中細(xì)菌群落的變化[16]等，但在糧食霉菌群落研究中，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用較少，僅有李聽聽等[17]利用DGGE技術(shù)研究了水分和環(huán)境濕度條件與糧食霉菌群落的相關(guān)性。為了研究玉米儲藏過程中霉菌群落的發(fā)生規(guī)律，建立儲糧霉菌污染預(yù)測模型積累理論和數(shù)據(jù)，本研究采用DGGE技術(shù)，對玉米在糧庫儲藏過程中霉菌群落進(jìn)行研究，探討儲糧霉菌群落的時間和空間變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從河南的儲藏糧庫中采集儲藏玉米，玉米品種主要為鄭單958、浚單20、先玉335、偉科702。

為研究儲糧中霉菌群落的時間規(guī)律，分別采集了儲藏1a 2 個月、儲藏2a 2 個月、儲藏3a 2 個月的不同儲藏年限的玉米。為研究儲糧中霉菌群落在糧庫中的空間規(guī)律，采集了糧倉內(nèi)儲藏玉米樣品。同一個糧倉設(shè)中心、4 個角5 個點(diǎn)，每個點(diǎn)的樣品包含玉米糧堆的上中下層玉米，上層在糧面的10～20 cm處，中層在糧堆中間，下層在距底部20 cm處，仟樣是先上后下逐層仟樣，各點(diǎn)仟樣數(shù)量一致。把采集到的玉米樣品標(biāo)記清楚后，放置－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B超聲波振蕩器 中國上海早盈公司；H1850R低溫高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國Biometra公司；DCodeTMUniversal Mutation Detection System DGGE儀、Gel Doc XR＋凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米表面霉菌基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取玉米表面真菌[18-20]，稱取25 g玉米置于高壓滅菌過的錐形瓶中，加入40 mL滅菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），然后將裝有樣品的錐形瓶放入超聲波振蕩器中振蕩1 h，將液體取出。其中20 mL放入離心管，4 ℃、2 000 r/min離心5 min。取上清液于新的離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min以沉淀菌體。加入65 ℃預(yù)熱30 min的2% CTAB溶液2 mL，充分混勻，置65 ℃水浴1 h，期間適當(dāng)搖勻，期間每隔5～10 min混勻一次，取出后，放至室溫。之后按照酚-氯仿-異戊醇方法操作進(jìn)行[17]。

1.3.2 真菌18S rRNA部分片段的擴(kuò)增

利用DNAman軟件分析并選用Ns7F和Ns8R引物對擴(kuò)增真菌18S rRNA部分序列，帶有GC夾的Ns7F：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCC CCCGCCCCATAACAGGTCTGTGATGC和Ns8R：GCAGGTTCACCTACGGA[21]，PCR產(chǎn)物的大小為353 bp。50 μL反應(yīng)體系為：2×Pfu Master Mix 25 μL；上游引物GCNs7F 1 μL；下游引物Ns8R 1 μL；模板DNA 1 μL；Mg2＋0.2 μL；ddH2O 21.8 μL。真菌18S rRNA-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5min； 94 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE和測序

DGGE使用8%的聚丙烯酰胺凝膠，18S rRNA的變性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)適合的范圍為30%～60% （100%的變性劑中每100 mL中含有42 g尿素）。電泳運(yùn)行條件：1×TAE電泳緩沖液，85 V電壓，60 ℃恒溫、恒壓電泳12 h。電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色法對凝膠進(jìn)行染色0.5 h。將染色后的凝膠用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，獲得DGGE圖譜。將DGGE圖譜上的主要條帶分別進(jìn)行切膠回收，每份回收產(chǎn)物使用不帶GC夾子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序。將測序所得的序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST相似性比對，以相似度最高的比對結(jié)果作為該電泳條帶的物種注釋。

1.3.4 霉菌群落多樣性分析及統(tǒng)計分析

為分析儲藏玉米中霉菌群落的分布規(guī)律，本研究對不同年份的樣品和糧庫中不同空間分布的樣品中霉菌群落的多樣性進(jìn)行比較分析。凝膠成像系統(tǒng)獲得的DGGE圖譜利用Quantity One v4.6.9軟件進(jìn)行圖譜整體背景去除、泳道背景去除、條帶亮度分析，計算每個樣品中各個條帶亮度的相對值。將該數(shù)據(jù)導(dǎo)入PAST軟件（v3.15）[22]，利用PAST軟件的multivariate/non-metric-MDS對數(shù)據(jù)進(jìn)行非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）作圖分析，距離參數(shù)選擇Bray-Curtis dissimilarity；利用PAST軟件的multivariate/one-way-ANOSIM對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOSIM分析，計算各組之間霉菌群落整體差異的顯著性，距離參數(shù)選擇Bray-Curtis dissimilarity；利用PAST軟件的multivariate/Clustering/Neighbourjoining對各樣品的霉菌群落進(jìn)行聚類分析；將每個條帶的物種注釋和亮度相對值數(shù)據(jù)導(dǎo)入LEfSe在線分析工具（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）[23]，分析不同類型樣品中具有顯著差異的霉菌類群。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGGE圖譜分析

為了研究儲藏玉米中霉菌群落的多樣性及時空分布規(guī)律，本研究用GC-Ns7F和Ns8R對18S rRNA的部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果如圖1所示。DGGE圖譜中條帶的亮度強(qiáng)弱表明相應(yīng)霉菌物種豐度的高低。從DGGE圖譜整體上看，不同儲藏年限的樣品中霉菌群落DGGE條帶圖譜具有比較明顯的差異，儲藏1 a的樣品（15A～15E）霉菌群落中高亮度條帶較多。而儲藏2 a的樣品（14A～14E）和儲藏3 a的樣品（13A～13E）霉菌群落中高亮度條帶逐漸較少。表明玉米儲藏過程中，優(yōu)勢菌群的多樣性逐漸減少，這可能是由于玉米儲藏過程中營養(yǎng)成分的變化及霉菌間相互競爭所導(dǎo)致的。而與儲藏年份相比，糧庫中不同空間位置樣品的條帶圖譜比較相似，這可能是由于取樣糧庫中不同空間的環(huán)境條件較為一致。

圖1 不同年份及糧庫不同空間位置的儲藏玉米中霉菌群落的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE pattern of mold communities in stored corn for different years at different spatial locations in the depot

表1 DGGE圖譜中的主要條帶測序分析Table1 Sequencing of main DGGE bands

對DGGE圖譜中的主要條帶進(jìn)行切膠回收、PCR擴(kuò)增和Sanger測序，并通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果如表1所示?？梢钥闯鰞Σ? a和儲藏2 a的樣品中，亮度最高的條帶（DGGE圖譜中標(biāo)注為3和9）物種注釋為Zea mays，即來源于玉米的的基因組的擴(kuò)增產(chǎn)物。這可能是由于儲藏年限長導(dǎo)致玉米細(xì)胞壁破損，致使霉菌基因組DNA提取結(jié)果中混有較多的玉米基因組DNA，由于不同DNA模板在PCR擴(kuò)增中的競爭性，可能導(dǎo)致儲藏2 a的樣品和儲藏3 a的樣品的DGGE圖譜中其他霉菌條帶亮度較低。因此在后續(xù)多樣性分析中，將所有樣品注釋為Z. mays的條帶去除，重新計算其他條帶的相對豐度。從霉菌種類上來看，此糧庫中霉菌污染以青霉為主，如產(chǎn)紫青霉菌Penicillium purpurogenum、微紫青霉菌P. janthinellum、草酸青霉菌P. oxalicum及一株未鑒定到種的青霉物種Penicillium sp.，此外還發(fā)現(xiàn)了總狀毛霉Mucor racemosus和假灰綠曲霉Aspergillus pseudoglaucus。此外還檢測到部分非霉菌的真菌物種，如Sakaguchia dacryoidea、Candida quercitrusa、Meyerozyma guilliermondii。

2.2 儲藏玉米中霉菌群落的時空分布規(guī)律分析

圖2 不同儲藏玉米樣品中霉菌群落DGGE圖譜的NMDS作圖分析Fig. 2 NMDS plot for DGGE patterns of molds communities from different stored corn samples

為了進(jìn)一步分析儲藏玉米中霉菌群落的時間和空間分布規(guī)律，本研究將DGGE圖譜中各真菌條帶的相對豐度值輸入PAST軟件進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。如圖2所示，NMDS可以在二維坐標(biāo)中顯示各個樣品霉菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，圖上兩個樣品點(diǎn)之間的距離越近，表明兩個樣品的霉菌群落結(jié)構(gòu)越相似。從圖2可以看出，儲藏時間相同的樣品中霉菌群落的點(diǎn)距離相對較近，出現(xiàn)聚類現(xiàn)象，而糧庫中相同方位的樣品的霉菌群落未出現(xiàn)聚類。該NMDS圖譜的Stress值為0.137 2，表明該NMDS圖譜具有較好的擬合度。利用one-way ANOSIM算法可以對上述聚類現(xiàn)象進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析以判定顯著性，結(jié)果表明，當(dāng)以儲藏時間點(diǎn)為各樣品分組依據(jù)時，儲藏1 a的樣品與儲藏2 a的樣品之間、儲藏1 a的樣品與儲藏3 a的樣品之間均具有顯著性的分離聚類（P＜0.05），而儲藏2 a的樣品與儲藏3 a的樣品之間的分離聚類不顯著（P=0.35）。當(dāng)以糧庫空間位置為各樣品的分類依據(jù)時，所有組之間分離聚類的結(jié)果均為不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同儲藏玉米樣品中霉菌群落樹狀聚類圖Fig. 3 Cluster dendrogram for mold communities from different stored corn samples

如圖3所示，相同年份的樣品在樹狀聚類圖上的位置很近，表明他們的霉菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。儲藏2 a的樣品中，有2 個樣品在儲藏1 a樣品的分枝上，另外3 個樣品在儲藏3 a樣品的分枝上，即儲藏2 a的樣品在樹狀聚類圖上處在儲藏1 a和儲藏3 a的樣品之間，呈現(xiàn)出過渡期的狀態(tài)。由此可見，儲藏玉米中霉菌群落的變化與其儲藏時間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，而與其在糧庫中的空間位置相關(guān)性較小。

2.3 儲藏玉米中霉菌群落與儲藏時間的相關(guān)性特征

圖4 不同儲藏玉米樣品中霉菌群落Alpha多樣性Fig. 4 Alpha diversity of mold communities from different stored corn samples

采用微生物群落多樣性研究中最為常用的Simpson指數(shù)作為樣品內(nèi)霉菌物種多樣性（Alpha多樣性）的評估指標(biāo)，如圖4所示。儲藏2 a的樣品中霉菌群落的物種多樣性略高于其他兩個儲藏時間點(diǎn)的樣品，但各組數(shù)據(jù)之間的差異均不顯著。儲藏2 a的樣品多樣性略高可能與其處于過渡期狀態(tài)有關(guān)，過渡期狀態(tài)的樣品可能兼具儲藏1 a和儲藏3 a的霉菌群落的特征。

圖5 不同儲藏時間樣品中霉菌群落的LEfSe分析Fig. 5 LEfSe analysis of mold communities from stored corn for different years

利用LEfSe在線分析工具可以分析各儲藏時間點(diǎn)的樣品的霉菌群落中的特征霉菌。如圖5所示，Penicillium sp.及一個未測序的條帶所代表的霉菌為儲藏1 a樣品的特征霉菌菌種，Candida sp.為儲藏3 a樣品的特征霉菌菌種，而儲藏2 a的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)特征霉菌菌種，這可能是由于儲藏2 a的樣品霉菌群落特征處于儲藏1 a和儲藏3 a樣品霉菌群落特征的過渡期，因此該時間點(diǎn)的樣品沒有獨(dú)有的霉菌種類。

3 討 論

本研究團(tuán)隊在之前的報道中曾提出，依據(jù)預(yù)測微生物學(xué)，構(gòu)建儲糧中微生物生長預(yù)測模型，可以快速對儲糧中微生物的生長情況進(jìn)行判斷，對儲糧中病原微生物和腐敗微生物的控制有重要作用[8]。霉菌是對儲糧危害最為嚴(yán)重的微生物，對人類健康具有多方面的影響。為了建立儲糧中霉菌群落生長預(yù)測模型，一方面要選擇適當(dāng)模型算法對霉菌群落生長進(jìn)行模擬，另一方面需要實(shí)測的數(shù)據(jù)，對儲糧霉菌群落的規(guī)律進(jìn)行研究，并對各生長預(yù)測模型進(jìn)行評估和優(yōu)化。從本研究的結(jié)果可以看出，在生態(tài)環(huán)境條件均勻的同一糧倉中，不同空間位置的樣品霉菌群落相似度較高，而不同儲藏時間的樣品霉菌群落具有較大的差異。因此在后續(xù)建立霉菌生長預(yù)測模型時，應(yīng)將儲藏時間設(shè)為主要因素之一，而將在糧庫中的空間位置定為次要因素。

在傳統(tǒng)的DGGE數(shù)據(jù)分析中，主要采取樹狀圖聚類分析研究泳道帶型的相似性[24-26]。本研究參照了16S rRNA擴(kuò)增子測序中的數(shù)據(jù)分析方法[27-30]，將NMDS、ANOSIM、Simpson多樣性指數(shù)、LEfSe等分析引入了DGGE結(jié)果分析中，對DGGE數(shù)據(jù)進(jìn)行了更加深入全面的研究。這些方法揭示了儲藏1 a和儲藏3 a的儲藏玉米樣品中霉菌群落具有較大的差異，而儲藏2 a樣品的霉菌群落處于過渡期狀態(tài)，這表明糧庫中玉米儲藏的第2年可能是霉菌群落控制的關(guān)鍵時期。本研究發(fā)現(xiàn)儲藏玉米中主要的污染霉菌為青霉，此外還包括毛霉和曲霉，這與孫武長等[3]報道的儲糧中危害最普遍的霉菌為曲霉和青霉相一致。

為了建立準(zhǔn)確可靠霉菌群落模型，還需對儲糧霉菌群落進(jìn)行更多的基礎(chǔ)理論研究和數(shù)據(jù)收集。例如，不同糧食種類的霉菌群落可能不同，儲糧表層和儲糧內(nèi)部的霉菌群落可能不同，不同溫度、濕度的糧庫中霉菌群落類型可能不同。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)所采用的分子生物學(xué)方法，對上述問題進(jìn)行深入研究，可以得到對儲糧中霉菌群落特征的全面認(rèn)識。

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