夏 陽(yáng) 陳慧敏 胡姝穎 孫劍飛 章非敏,3 顧 寧,3

(1東南大學(xué)江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210009)(2南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210029)(3蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心, 蘇州 215123)

赤鐵礦型氧化鐵(αFe2O3)是最簡(jiǎn)單的鐵氧化物,廣泛存在于自然界中.它是室溫下最穩(wěn)定的鐵氧化物,不易腐蝕,不會(huì)被氧化或還原,具有無(wú)毒、價(jià)格低廉、耐候性良好、抗腐蝕能力強(qiáng)等特點(diǎn),在氣體傳感、催化、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.此外,它還是一種重要的半導(dǎo)體材料,在光催化降解環(huán)境污染物、光解水制氫以及鋰離子電池領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用.

近年來(lái),隨著對(duì)αFe2O3納米材料應(yīng)用研究的深入,其相關(guān)的生物學(xué)性質(zhì)研究也引起了廣泛關(guān)注.例如,Zhang等[1]研究了不同粒徑納米αFe2O3對(duì)Caco-2細(xì)胞的吸附和毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)粒徑對(duì)納米顆粒與細(xì)胞之間的吸附行為具有顯著影響.Bhattacharya等[2]研究了納米級(jí)和微米級(jí)αFe2O3顆粒對(duì)人肺細(xì)胞的毒性.目前,筆者尚未查閱到關(guān)于納米αFe2O3對(duì)多潛能分化干細(xì)胞增殖和成骨分化影響的研究報(bào)道.相關(guān)研究大都圍繞著氧化鐵的另一種晶型——磁赤鐵礦(γFe2O3)展開(kāi).γFe2O3因其獨(dú)特的磁學(xué)性能在磁共振成像檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)、組織工程等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.文獻(xiàn)[3-4]指出,一定濃度的納米γFe2O3對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞無(wú)毒性,不影響其存活、增殖及成骨分化能力.因此,需要研究納米αFe2O3對(duì)多潛能分化干細(xì)胞的作用,以比較不同晶型和磁學(xué)性質(zhì)的納米鐵對(duì)細(xì)胞的作用效果,探索其對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制,以更好地開(kāi)發(fā)納米鐵在生物醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用.

本文制備了二巰基丁二酸(DMSA)包裹的納米αFe2O3,采用透視電鏡(TEM)觀察其形貌,利用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)檢測(cè)其磁學(xué)性質(zhì),并研究了納米αFe2O3對(duì)人牙髓干細(xì)胞活力、增殖和成骨分化的影響.

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(humane dental pulp stem cells hDPSCs)由美國(guó)馬里蘭牙學(xué)院Pro Xu Hockin惠贈(zèng);αFe2O3和二巰基丁二酸(DMSA)購(gòu)自中國(guó)阿拉丁公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶購(gòu)自美國(guó)GBICO公司;CCK-8購(gòu)自美國(guó)恩佐生化公司;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;蛋白定量試劑盒Pierce BCA Protein Assay Kit購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司;細(xì)胞熒光染料購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司;青/鏈霉素、二甲基亞砜(DMSO)、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、地塞米松、抗壞血酸、茜素紅購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.使用儀器包括日本電子株式會(huì)社的JSM-840型掃描電鏡、美國(guó)MolecularDevices公司的SpectraMax M5型酶標(biāo)儀、日本電子株式會(huì)社的JEOL-7100型透射電子顯微鏡以及美國(guó)Lake Shore Cryotronics公司的Lakeshore 7470型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì).

1.2 αFe2O3的表面處理和形貌表征

將納米αFe2O3稀釋至約1 g/L,調(diào)節(jié)pH值為2.7,加入反應(yīng)瓶中.稱取鐵質(zhì)量1/4的DMSA,超聲溶解于DMSO溶液中,然后加入Fe2O3溶液中攪拌反應(yīng)5 h.反應(yīng)結(jié)束后離心洗滌樣品,將溶液裝入透析袋中,用透析夾夾住袋口,放入裝有雙蒸水的燒杯中,攪拌24 h.透析后即可得到穩(wěn)定的DMSA/αFe2O3膠體水溶液.利用TEM觀察其形貌,采用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)量其磁性.

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基和骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基.細(xì)胞形貌和增殖實(shí)驗(yàn)中采用完全培養(yǎng)基,配方為DMEM培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)10%的血清+體積分?jǐn)?shù)1%的青霉素/鏈霉素;細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中采用骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基,即在完全培養(yǎng)基中添加地塞米松、抗壞血酸、維生素D、β-甘油磷酸鈉.細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)將培養(yǎng)基作為對(duì)照組,αFe2O3培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組,其中αFe2O3在培養(yǎng)基中的濃度為10 μg/mL.

1.4 細(xì)胞增殖測(cè)定

細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種于96孔板中,于37 ℃,包含體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng).在接種后的第1,4,7,14 d,每孔加入包含體積分?jǐn)?shù)10% CCK-8的培養(yǎng)基孵育.培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后,從各孔中吸取液體滴入96孔板中,于酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)其吸光度值.

1.5 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

細(xì)胞接種4 d后,將細(xì)胞浸沒(méi)于熒光染料中后,在37 ℃孵箱中孵育15 min,然后用熒光顯微鏡檢測(cè)死活細(xì)胞情況和細(xì)胞鋪展?fàn)顩r.

1.6 堿性磷酸酶活性檢測(cè)

在2種培養(yǎng)基中細(xì)胞培養(yǎng)14 d后,進(jìn)行ALP檢測(cè).從孵箱中取出96孔板,采用PBS漂洗3遍,每孔加入50 μL體積分?jǐn)?shù)為0.25%的TritonX-100,置于37 ℃孵箱中2 h.然后加入100 μL反應(yīng)底物,再置于37 ℃孵箱中2 h,利用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405 nm處測(cè)量吸光度.將測(cè)得的吸光度值除以蛋白定量檢測(cè)值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以排除不同細(xì)胞數(shù)對(duì)ALP值的影響.

1.7 茜素紅染色

細(xì)胞培養(yǎng)21 d后,進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色和定量檢測(cè).hDPSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d,PBS清洗后,采用體積分?jǐn)?shù)為1%的福爾馬林固定30 min,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的茜素紅染色30 min,PBS清洗后拍照.然后,采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化十六烷基吡啶溶液溶解礦化物,利用酶標(biāo)儀于550 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有定量數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).每種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示,以p<0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果與分析

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,制備的αFe2O3呈棒狀,尺寸約10 nm×90 nm,顆粒之間單分散(見(jiàn)圖1).αFe2O3的形貌有納米棒、顆粒、多面體以及由多面體組裝的立方體,不同的制備方法和制備條件會(huì)產(chǎn)生不同形貌的αFe2O3[5].由此,可實(shí)現(xiàn)對(duì)納米αFe2O3尺寸和形貌的可控合成[6-7].材料的尺寸、結(jié)構(gòu)、組成、孔隙度和形貌對(duì)其性能產(chǎn)生不同的影響.在對(duì)細(xì)胞的作用上,材料尺寸、表面電荷和組成成分都會(huì)影響納米粒子的細(xì)胞攝取[8-9].

圖1 TEM照片

室溫下通過(guò)VSM測(cè)得樣品的磁滯回線,結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖可知,制備的αFe2O3沒(méi)有磁性,因此,可以排除磁性作用導(dǎo)致其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng).來(lái)自于磁性材料的剩磁作用可影響細(xì)胞的增殖和分化[10].

圖2 αFe2O3顆粒的VSM檢測(cè)結(jié)果

選用含納米αFe2O3的完全培養(yǎng)基與牙髓干細(xì)胞共培養(yǎng),納米αFe2O3的濃度為10和100 μg/mL.細(xì)胞在αFe2O3培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后,沒(méi)有檢測(cè)到表示死細(xì)胞的紅色熒光影像.表示活細(xì)胞的綠色熒光圖片顯示,在10 μg/mL αFe2O3培養(yǎng)基和正常培養(yǎng)基對(duì)照組中,大量活細(xì)胞都已經(jīng)完全鋪展,呈現(xiàn)出典型的長(zhǎng)梭狀,細(xì)胞形貌與細(xì)胞密度無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖3(a)和(b)).但是在100 μg/mL納米αFe2O3的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化(見(jiàn)圖3(c)).如圖4所示,在4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)處,10 μg/mL αFe2O3培養(yǎng)基組與正常培養(yǎng)基對(duì)照組的細(xì)胞增殖結(jié)果之間均沒(méi)有顯著差異(p>0.05).但當(dāng)納米αFe2O3在培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí),細(xì)胞增殖受到顯著抑制,這與圖3(c)顯示的該濃度αFe2O3培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響一致.當(dāng)濃度為5,10,50 μg/mL時(shí),則沒(méi)有檢測(cè)到這種不良作用.究其原因在于,高濃度下暴露出的鐵顆粒內(nèi)核可以催化產(chǎn)生ROS,激活氧化還原敏感性JNK信號(hào)通路[11],從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12].因此,選用質(zhì)量濃度為10 μg/mL的納米αFe2O3培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞成骨分化檢測(cè).

(a) 正常培養(yǎng)基

(b) 10 μg/mL納米αFe2O3 培養(yǎng)基

(c) 100 μg/mL納米αFe2O3 培養(yǎng)基

圖4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果

本研究中主要檢測(cè)了ALP活性和礦化物形成量這2個(gè)細(xì)胞成骨分化指標(biāo).骨向誘導(dǎo)10 d后,2組細(xì)胞的ALP 活性分別為(0.89±0.15)和(1.68±0.20) mU/mg 蛋白.由結(jié)果可知,第2組細(xì)胞的ALP活性較對(duì)照組明顯提高(p<0.01).骨向誘導(dǎo)21 d后,檢測(cè)2組中細(xì)胞的礦化物形成量,結(jié)果見(jiàn)圖5.由圖可知,第2組細(xì)胞染色更深,礦化結(jié)節(jié)更厚.定量檢測(cè)結(jié)果顯示,2組細(xì)胞的礦化物相對(duì)形成量分別為1.0±0.11和3.45±0.29,即第2組細(xì)胞的礦化物形成量較對(duì)照組明顯提高(p<0.01).

(a) 培養(yǎng)基

(b) 10 μg/mL納米αFe2O3培養(yǎng)基

納米材料對(duì)干細(xì)胞成骨分化的作用受納米材料種類和濃度影響.文獻(xiàn)[13-15]指出,不同種類和濃度的超順磁性氧化鐵納米材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng),所得結(jié)果各不相同.關(guān)于αFe2O3對(duì)牙髓干細(xì)胞這種多潛能分化干細(xì)胞成骨分化影響的研究較少.文獻(xiàn)[13]指出,納米γFe2O3對(duì)骨髓干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用與MAPK通路有關(guān).本研究中的體外成骨分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,10 μg/mL的納米αFe2O3對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化有促進(jìn)作用.

3 結(jié)論

1) 一定濃度的納米αFe2O3對(duì)牙髓干細(xì)胞的形態(tài)和增殖沒(méi)有影響.

2) 納米αFe2O3可以對(duì)牙髓干細(xì)胞的成骨方向分化起到促進(jìn)作用.

3) 本研究結(jié)果將為納米αFe2O3在生物醫(yī)學(xué)、骨組織工程等領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用提供理論依據(jù)并奠定基礎(chǔ).

4) 下一步工作是使用普魯士藍(lán)染色,同時(shí)利用TEM檢測(cè)細(xì)胞對(duì)納米αFe2O3的攝入及納米αFe2O3在細(xì)胞內(nèi)的分布情況,并在基因和蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證納米αFe2O3對(duì)牙髓干細(xì)胞成骨分化的影響.

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