尉 玉 藺卡賓 沙菁 張 艷 陳云飛

(東南大學江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計與制造重點實驗室, 南京 211189)(東南大學機械工程學院, 南京 211189)

近年來,固態(tài)納米孔和生物納米孔被廣泛應(yīng)用于生物分子檢測,基于納米孔的DNA測序方法最早由Kasianowicz等[1]提出,其原理是通過納米孔連接納米孔兩側(cè)的電解質(zhì)溶液,使用膜片鉗放大器在納米孔的兩側(cè)施加恒定電壓,從而產(chǎn)生一個恒定的基準離子電流,通過電泳驅(qū)動帶負電的DNA分子納米孔[2].DNA分子在納米孔內(nèi)的物理占位造成納米孔通道內(nèi)的電阻變化,引起離子電流的變化,形成表示生物分子特性的過孔信號.通過分析過孔信號的幅值大小、駐留時間,就可區(qū)分相應(yīng)生物分子的直徑、長度、形態(tài),甚至區(qū)分DNA的4種堿基(A,C,G,T)[3-4].

相比生物納米孔,固態(tài)納米孔更方便大規(guī)模集成制造,具有良好的穩(wěn)定性、形態(tài)可控、便于與納米器件進行裝配等優(yōu)勢[5],但由于受到納米孔直徑和厚度的制約以及難以控制納米孔表面電荷分布,傳統(tǒng)固態(tài)納米孔相對于生物納米孔的靈敏度較低[6].提高檢測靈敏度的一個有效方法是減小納米孔薄膜的厚度,可以在不增加噪音的基礎(chǔ)上同時增大基準離子電流和信號幅值,從而提升信噪比[7].

普通氮化硅納米孔的厚度約為10～20 nm,遠大于單個堿基的尺寸,因此提出可使用具有原子級厚度的二維材料進行DNA測序[8],如石墨烯為單層碳原子,厚度大約為0.34 nm,與單個堿基的尺寸相當.文獻[9-12]先后驗證了石墨烯用來制備納米孔進行DNA檢測的可行性.但是利用石墨烯納米孔測序存在石墨烯和DNA分子間的強相互作用[13]使DNA分子吸附在石墨烯表面的問題,因此必須采用表面修飾[11]、原子層沉積[10]來弱化表面的作用.

相比石墨烯,雖然單層MoS2厚度約為0.65 nm,大于石墨烯,但由于單層MoS2具有直接帶隙和優(yōu)異的場效應(yīng)性能[14],故MoS2納米孔可用于DNA等生物分子的檢測.單少層的MoS2可以通過機械剝離、化學氣相沉積[15]等方法獲得,因此為了深入探究MoS2納米孔在DNA分子檢測中的性能以及影響因素,本文通過機械剝離和轉(zhuǎn)移相結(jié)合方法將MoS2薄膜覆蓋在Si3N4孔上,對最終制備的MoS2納米孔進行一系列的實驗研究.

1 實驗原理和方法

1.1 實驗原理

圖1為實驗裝置圖,通過納米孔相連兩側(cè)溶液池,使用Axon膜片鉗放大器在溶液的兩端施加電壓,從而形成基準離子電流.由于λ-DNA帶負電,將DNA加入左側(cè)負極的液池中,在電泳驅(qū)動下DNA分子將會向正極移動,DNA分子通過納米孔時,由于物理占位將會導致基準離子電流的下降,并產(chǎn)生相應(yīng)的過孔時間,通過分析阻塞離子電流的幅值和時間,可以分析得到DNA分子的運動情況.本實驗所采用Takara公司生產(chǎn)的雙鏈λ-DNA,共有48.5 kbp,長度約為17 μm,直徑約為2.2 nm,所用溶液為含有濃度為1 mmol/L EDTA和10 mmol/L Tris的緩沖液,pH=8.0的氯化鉀溶液,實驗過程中將DNA溶液濃度稀釋為2 μg/mL,采用的電極是Ag/AgCl電極,膜片鉗為Axon,采樣頻率為10 kHz.

圖1 實驗裝置示意圖

1.2 納米孔的制備

用MoS2納米孔制備過程如下:

① 首先通過低壓化學氣相沉積技術(shù)(LPCVP)在大小為2.5 mm×2.5 mm×0.43 mm的硅基底兩側(cè)各沉積一層厚度為100 nm的Si3N4薄膜;在一側(cè)氮化硅基底上釋放一個正方形窗口,再通過濕法刻蝕技術(shù)在硅基底上不斷刻蝕正方形深槽直至形成100 μm×100 μm的懸空氮化硅薄膜,如圖2(a)所示.

② 在Si3N4薄膜的中心處通過光離子束刻蝕的方法加工出1 μm左右大小的微米孔,如圖2(b)所示.

③ 通過機械剝離(多次用膠帶粘取)的方法制備單少層MoS2樣品到氧化硅基底上,在光學顯微鏡下觀察尋找單少層MoS2,并記錄位置和大小,如圖2(e)所示.圖中，MoS2樣品的厚度約為5層,大小為4 μm×8 μm,之后在氧化硅基底上均勻涂上聚碳酸亞丙酯膠(0.125 g/mL,溶劑為丙酮).

④ 將聚碳酸亞丙酯薄膜加熱固化,薄膜會吸附著MoS2樣品,將薄膜取下,置于轉(zhuǎn)移臺的微觀操作手載玻片下方的聚二甲基硅氧烷緩沖層上;通過微觀操作手操作,將單少層MoS2樣品對準覆蓋在氮化硅芯片1 μm大小的孔上,如圖2(c)所示.然后通過微觀操作手壓緊.加熱氮化硅芯片至220 ℃,待聚碳酸亞丙酯薄膜液化,用丙酮去除氮化硅芯片上面殘余的聚碳酸亞丙酯.

⑤ 用聚焦離子束在MoS2薄膜的中心區(qū)域加工出20～50 nm的MoS2納米孔,如圖2(f)所示.

(a) 氮化硅薄膜

(b) 刻蝕出1 μm的孔

(c) 將MoS2轉(zhuǎn)移到孔上

(d) FIB加工出MoS

2

納米孔

(e) 單少層MoS2樣品

(f) 轉(zhuǎn)移完成后SEM

圖2 MoS2納米孔的制備過程

普通氮化硅納米孔的制備只需在步驟①的基礎(chǔ)上,在氮化硅薄膜的中心區(qū)域1 μm×1 μm的正方形內(nèi),通過離子束刻蝕技術(shù)(FIB)將薄膜減薄至10 nm左右,在減薄區(qū)域用FIB加工出一個30 nm左右的納米孔.

為去除芯片表面雜質(zhì),以免影響基準離子電流,Si3N4芯片在打孔前和打孔后都需要用150 ℃的食人魚溶液(體積比V(H2SO4)∶V(H2O2)=3∶1)浸泡20 min,再用去離子水清洗3遍,最后用氮氣吹干.轉(zhuǎn)移完成制備的MoS2納米孔需要先后用丙酮、無水乙醇和去離子水清洗,并用高純氮氣吹干,最后用Plasma進行表面等離子處理.

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 不同電壓對DNA通過MoS2納米孔的影響

(a) MoS2納米孔SEM圖

(b) MoS2拉曼光譜圖

(c) 1 mol/L KCl溶液中的電流-電壓曲線圖

(1)

式中,σ為KCl溶液的電導率;L為MoS2薄膜的厚度;d為納米孔的直徑.1 mol/L KCl溶液的電導率σ=10.2 S/m;MoS2薄膜為5層,L=3.2 nm,納米孔直徑d=30 nm,將以上參數(shù)代入式(1)得到納米孔的電導G≈248 nS,該值接近于實驗值252 nS.

400,500和700 mV三種電壓下所檢測的DNA分子通過納米孔時造成的堵塞離子電流幅值和過孔時間散點分布圖如圖4(a)所示.可以看出,3種電壓下幅值區(qū)分較為明顯.圖4(b)～(d)是3種電壓下統(tǒng)計的阻塞離子電流幅值分布和Gauss分布峰值擬合圖.400 mV電壓時阻塞離子電流峰值約為1.27 nA,500 mV時約為1.77 nA,700 mV電壓時阻塞離子電流峰值增加到2.79 nA,可以發(fā)現(xiàn)隨著電壓的升高,阻塞離子電流幅值也在增加.采用歸一化的標準幅值比ΔI/I0來進行對比,其中I0為基準離子電流；ΔI為阻塞離子電流幅值，如圖4(e)～(g)所示,電壓從400 mV上升到700 mV時,ΔI/I0從0.016 9提高到0.022 9.標準幅值比ΔI/I0由DNA在MoS2納米孔中的空間占位大小所決定,空間占位越大,標準幅值比越大,也即電導的變化率增大.ΔI/I0的增大表明,隨著電壓的升高,DNA在受限空間內(nèi)和納米孔之間的相互作用變強,使得DNA在納米孔中的空間占比增大,DNA更傾向于以非折疊形式轉(zhuǎn)變?yōu)檎郫B形式過孔.

(a) 堵塞離子電流幅值和過孔時間散點分布圖

(b) 400 mV幅值分布圖

(c) 500 mV幅值分布圖

(d) 700 mV幅值分布圖

(e) 400 mV幅值比分布圖

(f) 500 mV幅值比分布圖

(g) 700 mV幅值比分布圖

(h) 400 mV過孔時間分布圖

(i) 500 mV過孔時間分布圖

(j) 700 mV過孔時間分布圖

圖4(h)～(j)是DNA分子在3種電壓下通過MoS2納米孔時間的分布及峰值擬合圖.400 mV電壓時過孔時間峰值約為0.427 7 ms,500 mV電壓時過孔時間峰值減小到0.389 0 ms,而當電壓為700 mV時過孔時間峰值約為0.231 8 ms.可以發(fā)現(xiàn)隨著電壓的升高,DNA分子通過納米孔的過孔時間隨之降低.隨著電壓的升高,DNA分子通過MoS2納米孔所造成的離子電流幅值增加,過孔時間減少,說明電壓升高,驅(qū)動力提高,DNA分子的過孔速度更快.

2.2 溶液濃度對DNA通過MoS2納米孔的影響

改變?nèi)芤簼舛?分別使用濃度為0.1,0.5和1.0 mol/L的KCl溶液進行實驗,施加800 mV電壓,對DNA分子的過孔時間和幅值進行對比.

圖5(a)為標準幅值比ΔI/I0和過孔時間散點分布圖,阻塞離子電流幅值和標準幅值比的分布如圖5(b)～(g)所示.從圖中可以看出,隨著濃度的降低,阻塞離子電流幅值峰值從1.93 nA降低到0.72 nA,但是標準幅值比ΔI/I0的峰值卻從0.012 2提高到0.023 8.孔內(nèi)離子電流計算公式[17]為

(a)ΔI/I0和過孔時間散點分布圖

(b) 1.0 mol/L幅值分布圖

(c) 0.5 mol/L幅值分布圖

(d) 0.1 mol/L幅值分布圖

(e) 1.0 mol/L幅值比分布圖

(f) 0.5 mol/L幅值比分布圖

(g) 0.1 mol/L幅值比分布圖

(h) 1.0 mol/L過孔時間分布圖

(i) 0.5 mol/L過孔時間分布圖

(j) 0.1 mol/L過孔時間分布圖

(2)

ΔI=ΔGΔV

(3)

(4)

式中,ΔV為施加電壓;ΔG為電導變化量.ΔI/I0可以等價于ΔG/G,當KCl溶液濃度在0.1～1.0 mol/L范圍內(nèi)時,孔內(nèi)電導G近似呈線性增長[18],因此基準離子電流I0也呈線性增大,同時基準離子電流增大引起幅值ΔI增大.而ΔG/G隨著KCl濃度的提高逐漸下降[19],當KCl濃度從0.1 mol/L增加到1.0 mol/L時,ΔG/G減小,ΔI/I0也減小.

不同濃度下過孔時間分布如圖5(h)～(j)所示,從圖中可看出,當溶液濃度從0.1 mol/L向1.0 mol/L變化時,DNA的過孔時間分布的峰值從0.292 ms增長到了0.597 ms,說明隨著溶液濃度的增加,DNA的過孔速度降低.由于DNA分子表面帶負電,溶液濃度改變時,吸附在DNA表面上的陽離子數(shù)目也會變化,濃度增加時,DNA分子表面吸附的K+增多,有效凈電荷減少,驅(qū)動電壓不變時,驅(qū)動力減小,從而過孔速度變慢,過孔時間增加[20].

2.3 不同納米孔實驗結(jié)果對比

為了對比MoS2納米孔和Si3N4納米孔的性能,實驗使用了直徑相近的MoS2納米孔和Si3N4納米孔進行對比,在800 mV電壓下,2個納米孔的基準離子電流接近.

圖6(a)為DNA分子通過2種納米孔時的時間和幅值分布散點圖,可以看出,兩者的幅值有較為明顯的區(qū)分.圖6(b)為消除納米孔尺寸的影響,使用標準幅值比ΔI/I0進行比較.根據(jù)ΔI/I0頻率分布及峰值擬合圖可見,Si3N4納米孔的ΔI/I0峰值分別為0.003 6和0.007 8,MoS2納米孔的ΔI/I0峰值約為0.012 2.對比發(fā)現(xiàn),由于MoS2薄膜的超薄特性,使得DNA分子在MoS2納米孔中的空間占位比更大,所檢測的離子電流幅值以及標準幅值比ΔI/I0約為Si3N4納米孔的3倍,這證明了MoS2納米孔具有更高的靈敏性.

文獻[21]通過α-溶血素納米通道的空間限域效應(yīng)研究了DNA(B40)和P53蛋白的弱相互作用,該弱相互作用的原理是根據(jù)兩者結(jié)合后相互作用發(fā)生變化，使阻塞離子電流隨之相應(yīng)改變.文獻[22]采用不同大小的Si3N4納米孔進行DNAT8的檢測,發(fā)現(xiàn)納米孔尺寸越小,DNA在孔內(nèi)受限空間越大,所造成的阻塞離子電流比和通過納米孔的時間均越大.從圖6可以看出,DNA通過Si3N4納米孔的阻塞離子電流和標準幅值比均存在2個峰值,這是由于DNA通過納米孔的方式不同造成的空間限域不同所引起的,DNA通過Si3N4納米孔內(nèi)標準幅值比計算公式為[23]

(a) 過孔時間及幅值散點圖

(b) 標準幅值比ΔI/I0對比

(5)

式中,dDNA為DNA的直徑;dpore為納米孔的直徑,本實驗中,dpore=39 nm.根據(jù)DNA通過Si3N4納米孔的標準幅值比ΔI/I0,計算出峰值0.003 6對應(yīng)的DNA直徑為d1=2.34 nm,峰值0.007 8對應(yīng)的DNA直徑為d2=3.43 nm,而雙鏈DNA直徑為2.2 nm,因此可以推斷DNA在Si3N4納米孔中分別以非折疊和折疊2種形式過孔.

通過對比DNA兩種納米孔的過孔時間可以發(fā)現(xiàn),雖然MoS2薄膜的厚度比氮化硅納米孔的厚度小,相同電壓下施加在納米孔上的電勢要高,但同時DNA分子駐留在納米孔中的片段所帶的電荷量也較小[10],因此電泳驅(qū)動力相同,導致過孔速度變化不大.

3 結(jié)論

1) 通過機械剝離、轉(zhuǎn)移的方法獲得單少層MoS2，并用聚焦離子束制備了MoS2納米孔.

2) 隨著電壓的升高,λ-DNA通過MoS2納米孔時所產(chǎn)生的阻塞電流信號幅值和標準幅值比都隨著電壓的升高而升高,過孔時間隨著電壓的升高而減小.

3) 隨著KCl溶液濃度的降低,λ-DNA通過MoS2納米孔時產(chǎn)生的阻塞電流信號幅值隨之下降,標準幅值比卻隨之升高,同時過孔時間減少.

4)λ-DNA通過MoS2納米孔所產(chǎn)生的阻塞離子電流幅值明顯高于通過Si3N4納米孔的阻塞離子電流,歸一化后的標準幅值比提升約3倍,證明二硫化鉬薄膜具有更高的靈敏性和信噪比.

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