陸娣 李莉 鄧賢明

近年來，基因編輯領(lǐng)域取得了飛速的發(fā)展，鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated）系統(tǒng)大大改變了科研人員在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中研究基因及其功能的方式。相較于ZFN和TALEN采用蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)識別物，CRISPR/Cas9采用特殊小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）靶向目標(biāo)基因，操作簡單快捷，成本低廉，脫靶效應(yīng)較低，已經(jīng)成為基因功能研究領(lǐng)域強(qiáng)有力的武器。在新藥研發(fā)過程中，高效的靶點(diǎn)篩選和驗(yàn)證是極其關(guān)鍵的步驟。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了對靶基因的定點(diǎn)編輯，使得構(gòu)建動(dòng)物模型或細(xì)胞系模型更加便捷，極大地加速了藥物靶點(diǎn)的篩選驗(yàn)證及新藥的研發(fā)。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)歷史和作用機(jī)制

基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度十大科技進(jìn)展之一，被稱為“魔剪”和“上帝之手”，它的迅速崛起引發(fā)了生物醫(yī)學(xué)研究的革命。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡稱。早在1987年，日本科學(xué)家在對K12大腸桿菌堿性磷酸酶基因編碼區(qū)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)附近有串聯(lián)間隔重復(fù)序列，但功能尚不清楚。后來的研究發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，并于2002年正式命名。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，2005年，3個(gè)研究組同時(shí)發(fā)現(xiàn)間隔序列和感染細(xì)菌的病毒或噬菌體基因序列高度同源，從而推測這一系統(tǒng)可能是細(xì)菌抵御病毒和質(zhì)粒入侵的一種方式。2007年，DANISCO公司的科學(xué)家通過增加和敲除CRISPR位點(diǎn)中間的重復(fù)序列調(diào)節(jié)了嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）對噬菌體的敏感性。2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該系統(tǒng)的功能。

基于重復(fù)序列結(jié)構(gòu)和Cas蛋白亞類，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以分為3類：I型、II型和III型。相較I型和III型系統(tǒng)，II型CRISPR/Cas系統(tǒng)（即CRISPR/Cas9系統(tǒng)）成分最簡單，已經(jīng)被改造成為理想的基因編輯工具。2012年，Wiedenheft等闡明了II型系統(tǒng)的機(jī)制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含3個(gè)關(guān)鍵性組分：CRISPR RNA（crRNA）、反式激活crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）及Cas9核酸內(nèi)切酶。crRNA的一部分序列可與tracrRNA通過堿基互補(bǔ)配對，結(jié)合形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），另一部分則可與靶標(biāo)DNA位點(diǎn)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對。這種嵌合RNA能夠識別特定的NGG序列，即PAM位點(diǎn)，并引導(dǎo)Cas蛋白復(fù)合物結(jié)合到這個(gè)特定的位點(diǎn)上對DNA雙鏈進(jìn)行切割。通過對tracrRNA/crRNA進(jìn)行改造，可以構(gòu)建成一個(gè)具有引導(dǎo)作用的sgRNA，從而將Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步簡化為Cas9核酸內(nèi)切酶和sgRNA兩個(gè)組分。

當(dāng)Cas9對靶標(biāo)DNA進(jìn)行切割時(shí)，會造成DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB），隨即細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制。在非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)機(jī)制下能夠形成隨機(jī)的多個(gè)堿基插入或缺失，使編碼蛋白的基因發(fā)生移碼和錯(cuò)義等嚴(yán)重突變，阻礙蛋白行使正常功能；而在同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)機(jī)制下則可以實(shí)現(xiàn)精確的基因敲入遺傳修飾，如點(diǎn)突變、插入和表位標(biāo)記等。因此，通過這兩種修復(fù)機(jī)制，CRISPR/Cas9技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)基因敲除和基因敲入的基因組改造。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)的基本流程

CRISPR/Cas9技術(shù)主要包含引物設(shè)計(jì)、sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染、混合pool的篩選與鑒定和單克隆的分離與驗(yàn)證幾大步驟。

首先需確定待敲除基因的靶位點(diǎn)，找到該基因CDS（coding sequence）區(qū)，明確外顯子部分。一般來說，盡量選擇靠前的外顯子。對于蛋白編碼基因，若該蛋白具有重要結(jié)構(gòu)功能域，可以將基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子上。如果不能明確基因產(chǎn)物的性質(zhì)，可以選擇將待敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在起始密碼子（ATG）后的外顯子上。確定靶位點(diǎn)之后，即可選擇一段23～250 bp的外顯子序列輸入在線設(shè)計(jì)軟件中，自動(dòng)輸出sgRNA序列，也可手動(dòng)進(jìn)行選擇。將sgRNA序列克隆到sgRNA scaffold backbone（BB）質(zhì)粒上，與表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中，通過單克隆分選、擴(kuò)增和檢測，便可得到穩(wěn)定的基因敲除或特定點(diǎn)突變的細(xì)胞系。

若是為了實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因敲入，則需要將一個(gè)同源重組修復(fù)模板與sgRNA、Cas9蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中以介導(dǎo)同源重組修復(fù)。這個(gè)同源重組修復(fù)模板可以是質(zhì)粒模板（plasmid donor template）、雙鏈線性DNA模板（double-stranded DNA template）或單鏈寡核苷酸鏈（single-stranded donor oligonucleotides）。同源重組修復(fù)模板的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則：左右兩端同源臂長度至少40 bp，以90 bp為最佳；鏈的方向以與滯后鏈（lagging strand）結(jié)合為最好；突變位點(diǎn)距切割位點(diǎn)越近越好，且最好在PAM位置的5'端。以BTKC481S點(diǎn)突變?yōu)槔诎c(diǎn)突變的sgRNA序列兩端各加上90 bp的同源臂，得到一段203 bp的序列，并在sgRNA序列中引入同義突變以插入一個(gè)BamHI酶切位點(diǎn)，即可通過酶切驗(yàn)證陽性。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

藥物靶點(diǎn)的篩選和鑒定是新藥研發(fā)中的關(guān)鍵一環(huán)，也是耗資巨大的過程。因此，藥物開發(fā)需要一個(gè)良好的藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證的平臺。早期，這個(gè)平臺一直建立在“基因敲除”（genetic knockout）的模式動(dòng)物上，這項(xiàng)技術(shù)雖然能夠?qū)θ旧w上的單個(gè)基因進(jìn)行敲除，但是不能進(jìn)行“劑量效應(yīng)”（dose-response effects）的研究，也不能敲除對胚胎發(fā)育至關(guān)重要或者致死的基因，且周期長、價(jià)格高，極大限制了藥物研發(fā)進(jìn)程。RNA干擾技術(shù)（RNAi）的出現(xiàn)大大縮短了篩選藥物靶標(biāo)和先導(dǎo)化合物的時(shí)間，利用這項(xiàng)技術(shù)可以有效且高選擇性地靶向靶基因的mRNA，抑制靶基因表達(dá)。但RNAi技術(shù)存在重現(xiàn)性差和脫靶效應(yīng)較嚴(yán)重等問題，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致完全錯(cuò)誤的結(jié)果。CRISPR/Cas9因其強(qiáng)大的基因編輯功能，已被用于功能基因的篩選和編輯、藥物靶點(diǎn)的篩選與驗(yàn)證、動(dòng)物模型的構(gòu)建等多項(xiàng)領(lǐng)域，為新型藥物研發(fā)或先導(dǎo)化合物的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在功能基因篩選中的應(yīng)用

人類基因組的功能尚未完全揭示，許多疾病尚未找到合適的藥用靶點(diǎn)。基因組的不方便操作性極大地制約了疾病機(jī)制的揭示及藥物靶點(diǎn)的篩選研究。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)只需要通過建立一個(gè)sgRNAs文庫導(dǎo)入細(xì)胞中，再通過相關(guān)表型的評估，即可實(shí)現(xiàn)對基因組的大規(guī)模定點(diǎn)編輯，進(jìn)而揭示基因的生理功能，為新藥研發(fā)提供可靠的靶標(biāo)。2013年，來自英國桑格研究所的科學(xué)家們創(chuàng)建了一個(gè)可以靶向小鼠基因組內(nèi)全部基因的sgRNAs文庫，利用慢病毒將這些sgRNAs引入組成型表達(dá)Cas9蛋白的小鼠胚胎干細(xì)胞中以創(chuàng)造出突變的干細(xì)胞庫，并用梭狀芽胞桿菌細(xì)菌毒素α對這個(gè)突變的干細(xì)胞庫進(jìn)行遺傳篩選，從中發(fā)現(xiàn)27個(gè)已知的抗性基因和4個(gè)未被報(bào)道的抗性基因。

對于轉(zhuǎn)錄非編碼RNA的基因來說，僅有插入或缺失突變很可能對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表型沒有顯著影響，因此篩選起來較為困難。2014年，北京大學(xué)的魏文勝研究組開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒聚焦型人源細(xì)胞文庫和功能性基因篩選平臺，并結(jié)合深度測序技術(shù)，成功鑒定出了對炭疽和白喉毒素毒性至關(guān)重要的宿主基因，這將為新型抗菌藥物的研發(fā)提供靶點(diǎn)。此外，他們聯(lián)合哈佛大學(xué)的劉小樂教授，采用基于配對向?qū)NA（pgRNA）的方式，以慢病毒為載體構(gòu)建出pgRNA庫，在全基因組范圍內(nèi)對人源肝癌細(xì)胞系Huh7.5OC中的近700個(gè)與癌癥或其他疾病相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA）進(jìn)行了功能篩選。這種方法是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在兩種分別靶向目標(biāo)基因不同位點(diǎn)的sgRNA組合成的pgRNA指導(dǎo)下，對同一基因造成兩處DNA雙鏈斷裂，兩個(gè)斷裂點(diǎn)之間的基因片段可能會被DNA修復(fù)過程“遺漏”，最終不會出現(xiàn)在修復(fù)完畢的基因中。其基本策略可被用于對其他非編碼RNA功能的分析中，具有巨大的潛在應(yīng)用場景。

2016年底，F(xiàn)ulco等分別證明了基于CRISPR/Cas技術(shù)可以用于識別疾病相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)控元件。前者利用包含98000個(gè)sgRNA序列的文庫分析了MYC和GATA1基因周圍1.29 MB序列，他們利用失活形式的Cas9與KRAB蛋白相互融合從而沉默靶基因，在上百個(gè)調(diào)控元件中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)調(diào)控GATA1基因的增強(qiáng)子元件和7個(gè)調(diào)控MYC表達(dá)的增強(qiáng)子元件。后者則采用包含18000個(gè)sgRNA序列的文庫分析了vemurafenib耐藥性相關(guān)基因（CUL3、NF1和NF2）周圍100個(gè)堿基范圍，發(fā)現(xiàn)了影響黑色素瘤患者耐藥性基因的非編碼調(diào)控元件。這兩項(xiàng)研究延伸了CRISPR/Cas9技術(shù)在非編碼基因組研究中的應(yīng)用。

3.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在藥物靶點(diǎn)篩選與驗(yàn)證中的應(yīng)用

在新藥研發(fā)中，藥物與靶點(diǎn)之間相互作用的驗(yàn)證是必不可少的。找到耐藥性突變可謂是確定靶點(diǎn)的黃金準(zhǔn)則，而在野生型背景的細(xì)胞中引入耐藥性突變則是靶點(diǎn)驗(yàn)證最后的關(guān)鍵一步，如rapamycinTOR1這對重要的藥物靶點(diǎn)組合的發(fā)現(xiàn)。將CRISPR/Cas9技術(shù)與全基因組測序及耐藥性突變篩選結(jié)合，能夠使得靶點(diǎn)驗(yàn)證更加高效。

2014年，Wang等利用包含73000個(gè)sgRNA序列的文庫對HL60和KBM7兩株細(xì)胞進(jìn)行篩選，驗(yàn)證了靶基因MSH2、MSH6、MLH1和PMS2能修復(fù)6-TG引起的DNA損傷，及靶基因TOP2A能抵抗依托泊苷（etoposide）的毒性。隨后，Shalem等建立了靶向18080個(gè)基因的包含64751個(gè)sgRNA序列的全基因組范圍的CRISPR/Cas9敲除（GeCKO）文庫，該文庫能在人類細(xì)胞中進(jìn)行正向和負(fù)向選擇性篩選。他們利用GeCKO文庫鑒定了對癌細(xì)胞和多能干細(xì)胞細(xì)胞活力必不可少的基因，并在A375黑色素瘤模型中篩選出了與維羅非尼耐藥性有關(guān)的基因，如先前發(fā)現(xiàn)的NF1和MED12，及未被發(fā)現(xiàn)的NF2、CUL3、TADA2B和TADA1。同年，劍橋大學(xué)的Smurnyy等通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和耐藥性克隆測序技術(shù)驗(yàn)證了6-TG-HPRT1和triptolide-ERCC3這兩對藥物靶標(biāo)的配對關(guān)系，他們將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于單倍體細(xì)胞模型KBM7細(xì)胞中，表明這項(xiàng)技術(shù)對顯性耐藥性基因和隱性耐藥性基因的驗(yàn)證都有效。Neggers等則利用CRISPR/Cas9剪切之后的同源重組修復(fù)（homology-dorected repair，HDR）機(jī)制在急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat中精確地引入了XPO1C528S點(diǎn)突變，證實(shí)selinexor（KPT-330）能夠靶向并阻斷核輸出蛋白受體XPO1。2017年4月發(fā)表的一項(xiàng)研究中，研究人員組合使用CRISPR/Cas9技術(shù)和iPSC技術(shù)構(gòu)建出特定的巨噬細(xì)胞模型，證明免疫系統(tǒng)中的IRF5基因和IL-10RA基因在抵抗衣原體感染中起到關(guān)鍵性作用，這為治療由衣原體引起的疾病鑒定出了新的藥物靶標(biāo)。

目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行篩選的策略主要是靶向誘導(dǎo)候選基因（candidate genes）的5'外顯子產(chǎn)生突變，這種方法的缺陷在于容易產(chǎn)生保留部分功能的框內(nèi)突變體（in-frame variants），即使存在很強(qiáng)的遺傳相關(guān)性也可能觀察不到顯著的表型差異。為了克服這個(gè)問題，美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室的研究人員針對性地突變編碼蛋白功能域的外顯子，導(dǎo)致更多的無效突變（null mutation），從而大幅提高了陰性選擇的效率。在這項(xiàng)研究中，他們篩選了小鼠MLLAF9/NrasG12D急性髓系白血病細(xì)胞的192個(gè)染色質(zhì)調(diào)節(jié)性區(qū)域，結(jié)果找到了6個(gè)已知的藥物作用靶點(diǎn)及19個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)，表明CRISPR/Cas9技術(shù)在癌癥藥物靶點(diǎn)的篩選與驗(yàn)證上還有很大的優(yōu)化空間。

3.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在動(dòng)物模型構(gòu)建和疾病治療中的應(yīng)用

傳統(tǒng)小鼠模型的建立主要依賴于同源重組和抗生素的篩選，通常需要采用胚胎干細(xì)胞作為過渡，過程繁瑣且耗時(shí)，而CRISPR/Cas9技術(shù)大大縮減了構(gòu)建動(dòng)物模型的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。李大力和劉明耀課題組利用RNA注射法將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入小鼠受精卵中，相比DNA注射，該方法能更為有效地在小鼠胚胎中產(chǎn)生定點(diǎn)突變，并且不受小鼠遺傳品系的限制。迄今為止，研究者已利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建出人肝癌、肺腺癌等小鼠癌癥模型及B型血友病、心臟衰竭等小鼠疾病模型。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究者可以清除小鼠模型中潛伏感染的病毒基因組，如乙型肝炎病毒；也可以修復(fù)遺傳基因缺陷，如囊性纖維化等。2015年12月，《科學(xué)》雜志發(fā)表了3項(xiàng)關(guān)于CRISPR/Cas9技術(shù)在小鼠模型中的實(shí)驗(yàn)。在這3篇文章中，研究者均通過非致病性腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）成功移除杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Dunchenne’s muscular dystrophy，DMD）模型小鼠的肌萎縮蛋白基因第23號外顯子，從而改善了其肌肉的生化特性，使其骨骼肌和心肌萎縮蛋白的功能得到部分恢復(fù)。這些突破增長了研究者攻克其他危害人類健康的疾病及難治愈癌癥的信心。

2015年3月，美國加州拉西瑞亞大學(xué)的研究人員通過設(shè)計(jì)針對人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的sgRNA序列，引導(dǎo)Cas9蛋白在特定位置上對HIV病毒的DNA雙鏈進(jìn)行剪切，使得人體18%～72%感染細(xì)胞內(nèi)的HIV病毒失活。同年12月，美國杜克大學(xué)的研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建特定的轉(zhuǎn)錄激活子，誘導(dǎo)感染HIV的人類細(xì)胞表達(dá)所缺乏的限制因子APOBEC3G和APOBEC3B，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)Vif缺陷型HIV-1的復(fù)制，并部分抑制野生型HIV-1的傳染性。2016年3月，Kaminski等則利用一種特定的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，特異性地靶向HIV-1前病毒DNA，有效且安全地將HIV病毒從體外培養(yǎng)的人CD4＋T細(xì)胞中清除，這些根除HIV-1 DNA的T細(xì)胞可以正常地生長和發(fā)揮功能。這些研究成果有望應(yīng)用于HIV感染的臨床治療中。

除了艾滋病，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對治療其他疾病也有巨大的潛力。2015年9月，Canver等利用CRISPR/Cas9技術(shù)移除了控制人類造血干細(xì)胞中分子開關(guān)BCL11A的紅系增強(qiáng)子，使造血干細(xì)胞成熟后胎兒型血紅蛋白（HbF）明顯增加，成人型血紅蛋白（HbA）相對減少，而HbF能夠?qū)圭牋罴?xì)胞突變效應(yīng)。2016年11月15日，Cyranoski報(bào)道了由四川大學(xué)華西醫(yī)院盧鈾教授所主持的全球首個(gè)CRISPR技術(shù)的人體應(yīng)用，盧鈾教授研究團(tuán)隊(duì)通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除T細(xì)胞中抑制免疫功能的PD-1基因，并在體外進(jìn)行T細(xì)胞擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后，再回輸至非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)進(jìn)行腫瘤治療。10月28日，首名患者接受了該項(xiàng)治療。此后，四川大學(xué)的研究人員采用多功能高分子RGD-R8-PEG-HA對人工病毒進(jìn)行修飾，將一種安全性較高的靶向乳腺癌中MTH1基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)RRPHC/Cas9-hMTH1輸送至小鼠腫瘤模型中，并有效地抑制了腫瘤的生長，這項(xiàng)研究提供了一種嶄新的體內(nèi)導(dǎo)入CRISPR/Cas9質(zhì)粒的方式。這些研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向癌癥或其他疾病的藥物靶標(biāo)，將為人類疾病的治療帶來巨大的幫助。

4 CRISPR/Cas9技術(shù)的缺陷與改進(jìn)

雖然CRISPR/Cas9技術(shù)十分高效且應(yīng)用廣泛，但它也存在一定的限制性，只有當(dāng)目標(biāo)位點(diǎn)附近存在PAM序列時(shí)，Cas9蛋白才能進(jìn)行準(zhǔn)確切割，而它的脫靶效應(yīng)可能會使目標(biāo)基因以外的其他基因產(chǎn)生變化。這些問題的存在深深影響著該技術(shù)在治療應(yīng)用中的安全性和有效性，因此仍需不斷完善。目前，減輕CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)的常規(guī)方式包括改變sgRNA的二級結(jié)構(gòu)，縮短sgRNA序列的長度，利用FokI-Cas9融合核酸酶、純化的Cas9核糖核蛋白、配對的催化突變Cas9切口酶等，這些方法能實(shí)現(xiàn)較低的脫靶率，但也在一定程度上降低打靶效率。自CRISPR/Cas9技術(shù)誕生以來，科學(xué)家們?yōu)樗母倪M(jìn)和完善做出了不斷的探索，并取得了顯著的成果。

許多人類遺傳疾病都是由點(diǎn)突變引起，而當(dāng)前的基因組編輯方法不能高效地校正細(xì)胞中的突變，而且會發(fā)生隨機(jī)的核苷酸插入或刪除（indel）。CRISPR/Cas9技術(shù)的基因編輯作用基于sgRNA介導(dǎo)的Cas9酶切割造成的雙鏈斷裂，能校正單核苷酸突變的同源重組修復(fù)發(fā)生率很低，只有0.5%～20%，且只發(fā)生在細(xì)胞周期的S期和G2期。為了提高修正點(diǎn)突變的效率，同時(shí)減少indel的頻率，哈佛大學(xué)的Komor等讓Cas9部分失活，使它不能切割DNA雙鏈，但仍能結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上。同時(shí)，通過將Cas9與胞苷脫氨酶（鼠源APOBEC1）偶聯(lián)在一起，直接將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)換成尿嘧啶（U）。因此，在細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)上會產(chǎn)生一對錯(cuò)配的堿基對，即一條鏈上新產(chǎn)生的U與另一條鏈上的初始堿基G錯(cuò)配，從而引發(fā)錯(cuò)配修復(fù)，最終正確的堿基校正率可達(dá)到15%～75%，同時(shí)只有1%以下的序列發(fā)生indel。

2016年4月，美國格拉斯通研究所的研究人員將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs），將編碼dCas9的基因和編碼KRAB抑制結(jié)構(gòu)域的基因融合在一起，形成dCas9-KRAB融合基因并將其導(dǎo)入AAV病毒載體中，再轉(zhuǎn)導(dǎo)iPSCs和源自iPSCs的心肌細(xì)胞，從而在宿主細(xì)胞中表達(dá)這種融合蛋白，結(jié)果表明這種CRISPRi（CRISPR interfereence）系統(tǒng)比CRISPR/Cas9系統(tǒng)更加高效。劍橋大學(xué)和惠康基金會桑格研究所的研究人員則將一種一體化的Cas9 D10A切口酶載體與熒光激活的細(xì)胞分選富集后相結(jié)合，基于高通量基因型和表型單克隆篩選，在滿足低脫靶率的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了高效率的基因敲除和敲入。此外，科學(xué)家們還將四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合，建立了一種高效可控的基因編輯平臺sOPTiKO/sOPTiKD，可以在細(xì)胞發(fā)育任何階段的任何細(xì)胞類型中精密調(diào)控基因表達(dá)水平。

RNAi技術(shù)部分抑制基因表達(dá)，CRISPR/Cas9技術(shù)可以完全抑制基因表達(dá)。當(dāng)涉及藥物開發(fā)時(shí)，這兩者的區(qū)別變得非常重要，因?yàn)閷θ魏我环N藥物而言，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)100%的抑制是非常罕見的。將CRISPR與RNAi結(jié)合起來驗(yàn)證靶標(biāo)可能會是一種較為理想的方法。2015年，哈佛醫(yī)學(xué)院的一個(gè)研究小組結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)及RNAi技術(shù)，鑒定出了3個(gè)對腫瘤生長十分重要的基因mRNA-cap、Pitslre和CycT（對應(yīng)人源RNGTT、CDK11和CCNT1）。他們利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了TSC1或TSC2缺陷的突變果蠅細(xì)胞系，再用RNAi方法篩查其所有的激酶和磷酸酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因的敲低會引起TSC1/TSC2缺陷型細(xì)胞生長速度減慢，而對野生型細(xì)胞沒有影響。隨后，研究人員在哺乳動(dòng)物TSC2缺陷型細(xì)胞系中敲低這些基因，也發(fā)生了類似的生長抑制現(xiàn)象，這也說明這種跨物種的篩選策略可用于藥物靶點(diǎn)的鑒定。2017年，Liu等開發(fā)出一種CRISPRi平臺，也可以實(shí)現(xiàn)基因的部分抑制。他們靶向7種不同細(xì)胞系中的16401個(gè)lncRNA位點(diǎn)，并鑒定出其中499個(gè)lncRNA位點(diǎn)是細(xì)胞生長所需要的，而很多l(xiāng)ncRNA位點(diǎn)在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，這可能最終對靶向癌癥治療產(chǎn)生影響。

CRISPR技術(shù)還有許多奧秘尚待挖掘。2016年，Pawluk等發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9的“關(guān)閉開關(guān)”（offswitches），鑒定出了3個(gè)天然存在的、能夠抑制Cas9活性的蛋白質(zhì)家族，從而可以實(shí)現(xiàn)對CRISPR/Cas9的自由關(guān)閉?？茖W(xué)家們還鑒定出了一種能夠靶向和降解RNA的RNA導(dǎo)向酶（RNA-guided enzyme）C2c2，CRISPR/C2c2系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因組短暫的改變，并且能夠幫助細(xì)菌對抗病毒感染。近期，關(guān)于CRISPR/C2c2系統(tǒng)的最新研究表明，C2c2對雙鏈DNA的切割會產(chǎn)生7 nt的黏性末端，這是目前所有用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)中所能產(chǎn)生的最長黏性末端。此外，研究人員還找到了Cas9的一種潛在替代者——Cpf1酶。CRISPR/Cpf1也能在crRNA的引導(dǎo)下在人類細(xì)胞中剪切目標(biāo)DNA，而且還能對RNA進(jìn)行加工。隨后，CRISPR/Cpf1的晶體結(jié)構(gòu)也被解析。同時(shí)，Burstein等通過對不同地點(diǎn)采集到的微生物進(jìn)行宏基因組分析，發(fā)現(xiàn)了兩種新型的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，包括在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種Cas9酶和在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的兩種小Cas酶（CasX和CasY）。將CRISPR/CasX或CRISPR/CasY引入大腸桿菌中都可以阻止遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，但其是否具有基因組編輯功能還有待于進(jìn)一步研究。這些新的發(fā)現(xiàn)也表明尋找新形式的CRISPR還有巨大的可能性。

5 結(jié)語與展望

CRISPR技術(shù)已成為基因編輯最有效的手段之一，它在發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證藥物靶標(biāo)方面具有巨大潛力，也為癌癥及其他疾病的治療提供了新思路。利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域的外顯子造成突變，可對維持癌細(xì)胞生長存活及發(fā)育等過程具有重要作用的蛋白或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行大規(guī)模篩選，這對尋找合適的藥物作用靶點(diǎn)及開發(fā)癌癥治療藥物具有重要意義。本課題組已利用CRISPR/Cas9技術(shù)在特定癌癥細(xì)胞系中構(gòu)建激酶的點(diǎn)突變，作為藥物靶點(diǎn)篩選與驗(yàn)證的細(xì)胞模型。CRISPR/Cas9技術(shù)不僅在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮重要作用，在制藥業(yè)也漸漸嶄露頭角。如福泰制藥（Vertex）與CRISPR技術(shù)公司CRISPR Therapeutics簽約4年合作開發(fā)針對已經(jīng)有明確人類基因靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9藥物，主要針對囊腫性肺纖維化和鐮刀型貧血癥。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在廣受推崇的同時(shí)，它在人類生殖細(xì)胞或胚胎上的使用也引發(fā)了全球持續(xù)性爭議。如英國倫敦弗朗西斯克里克機(jī)構(gòu)的研究團(tuán)隊(duì)已獲得英國人類受精與胚胎管理局（HEFA）審核通過，即將開始編輯體外受精（IVF）的胚胎基因，該研究很可能制造出第一個(gè)基因改造的人類胚胎，而這也使得關(guān)于基因編輯的倫理爭論更加激烈。一方面，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷完善，它勢必得到更廣泛的應(yīng)用，對人類健康領(lǐng)域做出重大貢獻(xiàn)；另一方面，對于基因編輯技術(shù)，研究者最為需要的是認(rèn)真思考，制定出合理的規(guī)范，使其發(fā)揮出最積極的效用。

（摘自《藥學(xué)學(xué)報(bào)》2018年第1期）