肺炎克雷伯菌攜帶碳青霉烯酶KPC-2的基因環(huán)境的多態(tài)性研究
沈平華,仉英,蔣曉飛
摘要:目的:KPC(Klebsiella pneumoniaecarbapenemases)是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的主要原因,而KPC-2是KPC中最常見(jiàn)的類型之一。中國(guó)地區(qū)已經(jīng)報(bào)道的關(guān)于KPC-2的耐藥基因分別位于肺炎克雷伯菌中的pKP048和pKPHS2質(zhì)粒上,通過(guò)對(duì)質(zhì)粒全基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)了兩種攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境:pKP048(GenBank accession no:FJ628167.2)的耐藥基因位于一個(gè)完整的Tn1721樣轉(zhuǎn)座子中;pKPHS2(GenBank accession no:CP003224.1)上的基因環(huán)境為Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26樣的新結(jié)構(gòu),即Tn1721結(jié)構(gòu)被IS26在Tn3的tnpR處打斷,造成tnpATn3和IRL2Tn1721的丟失。blaKPC-2的基因環(huán)境是了解blaKPC-2播散途徑的重要信息,是進(jìn)行有效的院感控制的基礎(chǔ)。本研究將華山醫(yī)院自第一株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌檢出到該耐藥細(xì)菌廣泛播散的這段時(shí)期內(nèi)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌作為一個(gè)完整的樣本,運(yùn)用PCR及測(cè)序獲得攜帶blaKPC-2的完整的基因結(jié)構(gòu)及側(cè)翼序列,希望為下一步深入研究該耐藥基因的播散機(jī)制提供全面的基因背景。方法:收集華山醫(yī)院自2006年8月—2009年12月連續(xù)不重復(fù)的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌,共42株。運(yùn)用引物KPC-FOR:5'-TCGCTAAACTCGAACAGG-3'和KPCREV:5'-TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC-3',以抽提的質(zhì)粒為模板,對(duì)42株細(xì)菌進(jìn)行blaKPC-2篩選。隨后進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(MLST)。根據(jù)pKP048和pKPHS2的序列,設(shè)計(jì)了一系列PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序,分別用于檢測(cè)本批菌株中是否存在與上述已經(jīng)報(bào)道的blaKPC-2的基因環(huán)境相同的結(jié)構(gòu)。結(jié)合后續(xù)的crossing PCR可以覆蓋整個(gè)基因環(huán)境的序列。PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司純化后測(cè)序。根據(jù)Junction PCR與Mapping PCR的結(jié)果,當(dāng)出現(xiàn)區(qū)別與以上兩種結(jié)構(gòu)的新結(jié)構(gòu)時(shí),擬運(yùn)用代表性質(zhì)粒測(cè)序及以純質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR walking等方法,獲得整個(gè)新結(jié)構(gòu)的完整基因環(huán)境的序列。結(jié)果:42株肺炎克雷伯菌MLST分型顯示:5株屬于ST423,2株屬于ST65,1株屬于ST977,34株均屬于ST11型。展示了所有菌株攜帶blaKPC-2的基因結(jié)構(gòu)及該結(jié)構(gòu)兩側(cè)的序列。本批菌株檢測(cè)到了與pKP048和pKPHS2不同的blaKPC-2的基因環(huán)境。A型為Tn1721-blaKPC-2-Tn3樣結(jié)構(gòu),顯示具備與pKP048相似的blaKPC-2的基因環(huán)境,但該機(jī)構(gòu)上下游序列分別為parA基因和DNA distortion protein 3-like基因,而不是Tn1721的IRL2。A型結(jié)構(gòu),分別位于ST423、ST65、ST97型菌株中。B結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒均位于ST11型菌株中。B1型顯示具有與pKPHS2相同的blaKPC-2的基因環(huán)境,即Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26。且該結(jié)構(gòu)外圍也具備相同的基因結(jié)構(gòu)。B2型與B1型相比唯一的區(qū)別是J1陰性,以純質(zhì)粒為模板,運(yùn)用引物2R向一側(cè)Walking。該型Tn1721的IRR上游序列與K.pneumoniaJM45 plasmid p2(GenBank accession no:CP006658.1)上的一個(gè)功能未知的蛋白序列高度一致,與△IS26無(wú)相似性。B2與B1結(jié)構(gòu)中IS26的下游均連接著TniA基因。結(jié)論:華山醫(yī)院自碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌爆發(fā)初期,即存在blaKPC-2基因環(huán)境的多態(tài)性,提示其blaKPC-2播散可能存在不同的來(lái)源。尤其B1與B2存在不同的側(cè)翼序列,推測(cè)該結(jié)構(gòu)是一種新型的嵌合型可移動(dòng)元件,可能具備水平轉(zhuǎn)移的能力,轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生了不同位置的插入。本文在研究方法上也有一定的創(chuàng)新??朔诉\(yùn)用全質(zhì)粒測(cè)序后獲得攜帶blaKPC-2基因環(huán)境費(fèi)時(shí)費(fèi)力及難以進(jìn)行大樣本分析的弊端;同時(shí)以往的研究中,通常只是分析blaKPC-2上下游的一小段序列,完整展示了攜帶blaKPC-2基因環(huán)境,為進(jìn)一步分析該結(jié)構(gòu)可能的移動(dòng)模式和機(jī)制提供了有價(jià)值的基因背景。鑒于本文的局限性,下一步擬在菌株收集的時(shí)間和種類上進(jìn)一步擴(kuò)展,以獲得華山醫(yī)院耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌攜帶blaKPC-2的基因環(huán)境,為控制醫(yī)院感染提供有價(jià)值的信息??傊?,華山醫(yī)院耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的主要流行株為ST11型,且臨床數(shù)據(jù)顯示攜帶耐藥基因blaKPC-2的基因環(huán)境存在多態(tài)性,提出該耐藥基因的水平播散可能存在不同的機(jī)制,為下一步研究該耐藥基因的水平播散模式和機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。
來(lái)源出版物:中國(guó)感染與化療雜志, 2016, 16(6): 680-684
入選年份:2016
發(fā)熱門診血流感染154例病原學(xué)分析
李曉光,胥婕,姚貝
摘要:目的:通過(guò)分析發(fā)熱門診血流感染患者常見(jiàn)病原菌的分布和藥敏情況,為社區(qū)獲得性血流感染(BSI)的經(jīng)驗(yàn)性治療提供依據(jù)。方法:通過(guò)檢索北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)系統(tǒng)中2009年1月—2013年12月發(fā)熱門診的血培養(yǎng)化驗(yàn)單,對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果逐一人工查閱病歷。對(duì)臨床考慮為一次感染過(guò)程中多次血培養(yǎng)陽(yáng)性且為同一細(xì)菌者只收錄首次血培養(yǎng)結(jié)果,對(duì)于同一患者血培養(yǎng)為多種細(xì)菌者,分析為致病菌或污染菌的可能性后再納入。血流感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2001年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》。污染菌的判定參考美國(guó)CDC 1996年醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn),常見(jiàn)的皮膚寄殖菌如類白喉?xiàng)U菌、桿菌屬、丙酸桿菌屬、凝固酶陰性葡萄球菌、微球菌考慮污染菌可能。對(duì)于凝固酶陰性葡萄球菌,如果在培養(yǎng)72 h以上報(bào)警或者單次培養(yǎng)陽(yáng)性者不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。最終154例患者納入研究,分析其病原學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果:2009年1月—2013年12月發(fā)熱門診就診患者中1267例行血培養(yǎng)檢查,166例患者培養(yǎng)出菌株177株,9株為重復(fù)培養(yǎng),1例患者同時(shí)培養(yǎng)出大腸埃希菌和表皮葡萄球菌,1例患者同時(shí)培養(yǎng)出大腸埃希菌和芽孢桿菌,考慮表皮葡萄球菌和芽孢桿菌為污染菌。結(jié)合血培養(yǎng)報(bào)警時(shí)間大于72 h和培養(yǎng)出的菌種,另確定12株污染菌,包括葡萄球菌、棒狀桿菌、芽孢桿菌,故實(shí)際納入研究菌株154株(12.2%,154/1267)。154例患者中,男80例(51.9%),女74例(48.1%)。患者的平均年齡(57±20)歲,65歲以上為老年組有68例(44.2%,68/154)。與中青年組比較,老年組患者中男性比例更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.701,P=0.030)。有明確感染灶者68.2%,主要為肺部感染、急性腎盂腎炎、腸道感染、膽道感染、腹腔感染、肝膿腫等,多部位感染10例(6.0%)。血培養(yǎng)結(jié)果最終納入研究病原菌154株,其中革蘭陰性菌127株(82.5%),革蘭陽(yáng)性菌27株(17.5%)。革蘭陰性菌的報(bào)警時(shí)間(time to positivity):需氧培養(yǎng)(13.8±15.6)h,厭氧培養(yǎng)(13.3±16.2)h;革蘭陽(yáng)性菌的報(bào)警時(shí)間:需氧培養(yǎng)(16.9±9.5)h,厭氧培養(yǎng)(17.6±18.9)h;2種菌的報(bào)警時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大腸埃希菌的報(bào)警時(shí)間,需氧培養(yǎng)(14.9±14.3)h,厭氧培養(yǎng)(15.6±17.7)h。檢出病原菌第一位是大腸埃希菌82株(53.3%),其次是肺炎克雷伯菌19株(12.3%)、沙門菌屬15株(9.7%)、鏈球菌屬13株(8.4%)、凝固酶陰性葡萄球菌8株(5.2%)。大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類藥物敏感率100%,對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率80%以上,對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南的敏感率在60%~79%,對(duì)頭孢呋辛、頭孢曲松、左氧氟沙星的敏感率50%~60%。分析臨床經(jīng)驗(yàn)治療,病原菌對(duì)首選藥物89.2%呈現(xiàn)敏感。結(jié)論:發(fā)熱門診社區(qū)獲得性血流感染患者病原菌種類多樣,以革蘭陰性菌為主,第一位是大腸埃希菌;對(duì)多數(shù)患者而言,第三代頭孢菌素、喹諾酮類藥物經(jīng)驗(yàn)治療有效。
來(lái)源出版物:中國(guó)感染與化療雜志, 2016, 16(2): 123-128
入選年份:2016