（河南科技大學 動物科技學院，河南洛陽 471023）

1 前言

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是禽類B 細胞生長的最初發(fā)生位置，B 細胞生長成熟后由此轉(zhuǎn)移至周邊淋巴器官定居與增殖，實現(xiàn)免疫功能。法氏囊微環(huán)境里具備多種促使B 淋巴細胞生長的生物活性物質(zhì)，近年來，法氏囊組織里陸續(xù)分離鑒定出多條活性肽，其中BP-I是從法氏囊組織中新分離的生物活性肽，其免疫學作用尚不清晰，本研究擬通過人工合成法氏囊生物活性肽BP-I和禽流感H9N2滅活疫苗配合運用接種小鼠，通過測定小鼠體內(nèi)免疫指標水平變化評價BP-I對禽流感H9N2滅活疫苗免疫佐劑特性，開拓了佐劑的研發(fā)領域。

2 試驗材料與方法

2.1 主要材料

28日齡BALB/c普通級老鼠80只購自河南鄭州大學實驗動物中心，公母對半；禽流感疫苗（H9N2 亞型，SDS696株）購自乾元浩生物股份公司；禽流感病毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）和pET32a-HA（H9N2）質(zhì)粒，由本實驗室保存。BP-I標準品由上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?，純度＞95%。HRP標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體、TMB 底物、顯色液均購自鄭州鼎國生物技術有限責任公司；小鼠細胞因子含量測定 ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

2.2 試驗方法

2.2.1 動物分組及免疫

將80只28日齡BALB/c小鼠隨機分為4組，每組20只，分別是PBS組，單獨疫苗組、單獨疫苗+BP-I組和空白組，采取肌肉注射（i.m.）方式分別對各組小鼠（空白組除外）進行兩次免疫，每次免疫間隔2周，即所有組分別于0、14d進行首免和二免。

2.2.2 血清IgG抗體的測定

首免后7、21d分離小鼠血清，并采用ELISA方法檢測小鼠血清 H9N2 HA 抗體。

2.2.3 血清中IL-4和IFN-γ的測定

首免后7、21d對小鼠進行采血，如圖2-2-d所示，并分離小鼠血清，采用小鼠細胞因子含量測定 ELISA 試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。每次分析時，使用對照的細胞因子標準品繪制標準曲線，通過標準曲線來計算血清中細胞因子的含量。

2.2.4 動物免疫保護試驗

二免2周后（即首免后28d），經(jīng)口服途徑對各實驗組小鼠（20只/組）攻擊H9N2型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）100 μL（2.5×106TCID50/0.1 mL），設空白對照組，攻毒后各組小鼠隔離飼養(yǎng)。于攻毒后第7d分別從各組隨機抽取5只小鼠分離其肺臟，制作肺臟的HE切片來分析病變情況。HE染色及切片的制備委托武漢谷歌生物有限公司完成。

2.2.5 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 免疫小鼠血清中IgG抗體水平

于首免后7、21d分離小鼠血清進行IgG 抗體檢測，結(jié)果如圖1所示，首免后7d和21d時，疫苗+BP-I組和疫苗組小鼠血清中IgG抗體分泌水平均顯著高于PBS組（P＜0.01），疫苗+BP-I組小鼠血清IgG抗體分泌水平顯著高于疫苗組（P＜0.01），且首免后21d時較首免后7d時各組IgG抗體水平均進一步提高。表明法氏囊活性肽BP-I 能顯著提高免疫H9N2型AIV疫苗后小鼠IgG抗體分泌水平。

圖1 免疫 小鼠血清IgG抗體平均水平

3.2 小鼠血清細胞因子水平

首免后7、21d分離小鼠血清，采用小鼠細胞因子含量測定ELISA 試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量，以分析BP-I對H9N2型AIV疫苗免疫后小鼠的細胞免疫水平的影響。IL-4的分泌水平如圖2所示，7d與21d時均是：疫苗+BP-I組和疫苗組的細胞因子IL-4的分泌水平差異不顯著（P＞0.05），疫苗組與PBS組的IL-4的分泌水平差異極顯著（P＜0.01），疫苗+ BP-I組與PBS組的IL-4的分泌水平差異極顯著（P＜0.01），表明法氏囊活性肽 BP-I對于提高免疫后小鼠體內(nèi)細胞因子IL-4分泌水平作用不顯著。IFN-γ的水平變化如圖2所示，7d與21d時均是：疫苗+BP-I組和疫苗組小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均顯著高于PBS組（P＜0.01），疫苗+BP-I組小鼠血清中IFN-γ的分泌水平顯著高于疫苗組（P＜0.01），且首免后21d時較首免后7d時各組IFN-γ的分泌水平均進一步提高，表明法氏囊活性肽BP-I能夠提高免疫后小鼠體內(nèi)細胞因子IFN-γ的分泌水平。

圖2 免疫后各組小鼠細胞因子IFN-γ和IL-4水平變化

圖3 小鼠免疫后各組肝脾指數(shù)變化

3.3 小鼠肝臟和脾臟指數(shù)變化分析

小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)的變化如圖3所示，首免后7d和21d時均是：疫苗+BP-I組與疫苗組的肝指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）；疫苗+BP-I組和疫苗組的脾指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。說明法氏囊活性肽BP-I對免疫后小鼠的肝指數(shù)和脾指數(shù)變化的作用不顯著。

3.4 免疫小鼠的免疫保護試驗

由于H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）不能使小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和導致死亡，為有效評價各實驗組小鼠免疫保護力的差異，于二免2周后，對小鼠攻擊A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）100 μL（2.5×106TCID50/0.1 mL），同時設空白對照組，在攻毒后7d從各組隨機抽取5只小鼠采集其肺臟，制作肺臟的HE切片，和正常肺臟相比，PBS組肺泡壁出血嚴重，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量漿液和中性粒細胞；疫苗組與PBS組相比，肺泡壁出血減少、中性粒細胞減少；疫苗+BP-I組與疫苗組相比，肺泡壁出血明顯減少、中性粒細胞明顯減少。表明法氏囊活性肽BP-I配合疫苗能夠有效促進小鼠肺臟中病毒的清除，從而對小鼠起到免疫保護的效果。

4 討論

血清IgG抗體水平能夠反映被免疫動物的體液免疫應答能力，其檢測結(jié)果準確性較高，并且檢測操作步驟比較簡便。本試驗結(jié)果顯示，法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2滅活疫苗，在兩次免疫后可以顯著增強小鼠血清中IgG抗體水平，提高機體的體液免疫水平，對特異性免疫應答調(diào)節(jié)有著重大意義。細胞因子是一組在體內(nèi)免疫細胞或非免疫細胞中產(chǎn)生的異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子。細胞因子具有廣泛的生物活性，對免疫應答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用，是評價機體細胞免疫狀況的一個重要的免疫指標。細胞因子在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細胞，IL-4和IFN-γ分別為Th2和Th1類免疫反應的代表性細胞因子。試驗結(jié)果顯示法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2滅活疫苗免疫小鼠能夠顯著提高IFN-γ的分泌水平，對IL-4的分泌水平影響不顯著，能夠提高機體細胞免疫水平。小鼠脾臟的變化情況能夠表現(xiàn)總體的免疫變化，肝臟也是重要的臟器，而且取材較方便。肝脾指數(shù)可以較好地反映出小鼠機體的免疫情況。本實驗在首免后7d和21d時隨機取小鼠的肝、脾并稱重，并計算肝脾指數(shù)。結(jié)果表明：疫苗+ BP-I組的肝指數(shù)和疫苗組差異不顯著；疫苗+ BP-I組的脾指數(shù)和疫苗組差異不顯著。說明法氏囊活性肽BP-I與疫苗配合使用對小鼠肝臟和脾臟指數(shù)變化影響不大。本試驗在二免2周后對小鼠進行動物免疫保護試驗。由于選用的 H9N2亞型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05（H9N2）不能使小鼠出現(xiàn)明顯的流感臨床癥狀和導致死亡，而且以2.5×106TCID50的劑量感染小鼠后該病毒主要分布在其肝臟、脾臟和肺臟，其中肺臟中的帶毒量最多。因此，為有效評價BP-I的佐劑特性，我們只做了HE切片，結(jié)果顯示，攻毒后7d時疫苗+BP-I 組幾乎觀察不到小鼠肺臟的病變。表明BP-I 配合疫苗使用能夠抑制AIV 在小鼠肺臟中的復制。

法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用能顯著提高小鼠血清中IgG抗體的分泌水平。能顯著提高小鼠血清內(nèi)細胞因子IFN-γ的分泌水平，對IL-4的分泌水平影響不大。對小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)變化的作用不顯著。法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用會增強對小鼠肺臟的免疫保護作用。

[1] 鄭其升，劉華雷，張曉勇，等.H_9N_2亞型AIV HA基因的原核表達及間接ELISA方法的建立[J].中國病毒學，2005，20（3）：293-297.

[2] 沈克飛，曹蘭，尹繼剛，等.免疫佐劑研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2007，28（11）：34-36.