程瑩瑩,倪光夏,狄忠

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針刺內(nèi)關(guān)、水溝對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1表達(dá)的影響

程瑩瑩1,倪光夏2,狄忠1

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,杭州 310005;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,南京 210023)

探討針刺內(nèi)關(guān)、水溝抑制腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。40只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刺組。采用改進(jìn)的Longa線栓法制備大腦中動脈梗塞模型。參考Bederson6級5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分,運用Real-time PCR、Western Blot檢測腦缺血后24 h大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA及蛋白表達(dá)量變化。與模型組相比,針刺組可改善缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀(＜0.01);針刺可下調(diào)Caspase-3、PARP-1的mRNA及蛋白表達(dá),與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05,＜0.01;＜0.05,＜0.05)。針刺內(nèi)關(guān)、水溝可下調(diào)腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA及蛋白表達(dá)。

針刺;細(xì)胞凋亡;再灌注損傷;Real-time PCR;Western Blot;Caspase-3;PARP-1;大鼠

缺血再灌注引起腦組織損傷的機(jī)制眾多,神經(jīng)細(xì)胞凋亡是目前研究較多的機(jī)制之一,它是梗死周圍區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式[1-4]。腦缺血后介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的通路有Caspase依賴性的內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路;非Caspase依賴性凋亡通路[5-6]。本研究通過運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real- time PCR)、蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測mRNA及蛋白表達(dá)技術(shù),以Caspase依賴性凋亡通路中Caspase-3、非Caspase依賴性凋亡通路中PARP-1 mRNA及蛋白表達(dá)變化為觀察指標(biāo),探討針刺抑制急性腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組

選用上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供的健康成年雄性SPF級SD大鼠40只(合格證號為SCXK2008-0016),體重(260±20)g,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、針刺組,每組10只。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

一次性針灸針,規(guī)格為0.30 mm×25 mm(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);電子天平,CP512型(上海奧豪斯公司);4℃冰箱(西門子公司);VXE380超低溫冰箱(Thermo公司);高速冷凍離心機(jī),KendroBiofuge (Germany生產(chǎn));電動勻漿器、移液器(EPPendorf公司);紫外可見分光光度計(德國Eppendorf BioPhotometer);基因擴(kuò)增儀MJ-mini(BIO-RAD公司);實時熒光定量PCR儀(MX3000P,Stratagene公司);超凈工作臺(蘇凈集團(tuán));TY-80S脫色搖床(普陽科學(xué)儀器研究所);垂直電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)膜儀、制膠器(BIO-RAD公司產(chǎn)品)。

1.1.3 試劑、耗材

水合氯醛(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); Trizol(Invitrogen公司);異丙醇、無水乙醇、氯仿(南京寧試化學(xué)試劑有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo公司);Real- time PCR試劑盒(Promega公司);引物(上海捷瑞生物工程有限公司);BCA法檢測蛋白濃度試劑盒(Thermo公司);封閉蛋白干粉(武漢博士德公司);單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

采用改進(jìn)的Longa線栓法[7],SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g體重腹腔注射)麻醉,仰臥固定。頸部正中備皮后切開皮膚,鈍性分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈,仔細(xì)分離避免損傷迷走神經(jīng)。結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端,動脈夾夾閉頸總動脈近心端及頸內(nèi)動脈,靠近頸總動脈分叉處在頸外動脈上剪一小口,將直徑0.26 mm尼龍釣絲沿小口插入頸總動脈,移去頸內(nèi)動脈的動脈夾,經(jīng)頸總動脈分叉處將魚線緩慢向頸內(nèi)動脈入顱腦方向推進(jìn)約(18±2)mm,微遇阻力時停止,使魚線頭端到達(dá)較細(xì)的大腦中動脈起始處。于缺血2 h后拔出栓線,建立缺血再灌注模型。假手術(shù)組大鼠只分離暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈;正常組不進(jìn)行手術(shù)處理。

再灌注2 h進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn)參考Bederson 6級5分法,正常為5級(0分);對側(cè)上肢不能完全伸展為4級(1分);向?qū)?cè)推時抵抗力下降為3級(2分);提尾時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2級(3分);自動轉(zhuǎn)圈為1級(4分);無自發(fā)性活動、意識障礙為0級(5分)。神經(jīng)行為學(xué)評分達(dá)到2～4分視為造模成功,模型成功率大約50%。

1.2.2 干預(yù)方法

針刺組取內(nèi)關(guān)(雙)、水溝。根據(jù)中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”選取。在動物模型制備成功1 h后固定大鼠(各組均需固定,除針刺組其他組不進(jìn)行針刺治療),選用華佗牌0.30 mm×25 mm針灸針進(jìn)行一次針刺。先針刺雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴,直刺,行捻轉(zhuǎn)提插瀉法1 min;繼刺水溝穴,在鼻中隔下部向上斜刺,施雀啄手法刺激10次。

1.2.3 標(biāo)本處理

確認(rèn)各組模型已建立。造模后24 h斷頭處死大鼠,置于冰盤快速剝離手術(shù)側(cè)大腦皮層中段1/3,迅速置于液氮冷凍,稍后移至﹣80℃超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 大腦皮層總RNA和蛋白的提取

大腦皮層總RNA和蛋白提取具體步驟嚴(yán)格按照說明書操作。得到總RNA和蛋白質(zhì),﹣80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Real-time PCR檢測mRNA的表達(dá)

1.3.2.1 RNA逆轉(zhuǎn)錄

用紫外分光光度計在260 nm和280 nm波長處測定總RNA溶液的吸光度,進(jìn)行RNA濃度和純度分析, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。RNA純度和完整性滿足要求后,采用二步法進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。取樣品RNA 2mg,加入random hexamer primer 1mL,再加入無酶水,使得總體積為11mL,65℃,5 min后放置冰上。加入5X Reaction Buffer 4mL、RiboLock TM RNase Inhibitor(20m/mL)1mL,10 mM dNTP Mix 2mL, M-MuLV Reverse Transcriptase(20m/mL)2mL混勻, 25℃、5 min;37℃、60 min,終止反應(yīng),cDNA置﹣20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 引物設(shè)計

引物由PubMed中,通過Nucleotide查找獲得,并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列及長度見表1(其中GAPDH為內(nèi)參)。

表1 基因引物及序列

1.3.2.3 Real-time PCR

以GAPDH為內(nèi)參,采用SYBR Green熒光染料法。反應(yīng)體系中包括cDNA 100 ng、Real-time PCR Master Mix 10mL、上下游引物各0.5mL,加無酶水至20mL。反應(yīng)步驟為95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火延伸30 s,擴(kuò)增40個循環(huán);72℃ 1 min。55℃、30 s讀取熒光強(qiáng)度。

1.3.3 Western Blot法檢測蛋白表達(dá)

1.3.3.1 BCA法檢測蛋白濃度

根據(jù)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品,95℃變性5 min,通過分光光度計獲得吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出樣品蛋白濃度。

1.3.3.2 Western Blot

定量蛋白濃度后,取20mg溶解在6×loading Buffer中,加入1%SDS定容至20mL,95℃煮沸5 min。蛋白上樣20mL,12%的分離膠、5%濃縮膠電泳。濕法轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜上,30 mA,4℃過夜。根據(jù)分子量大小將膜裁成3份,分別加兔抗鼠b-actin、Caspase-3、PARP-1一抗(稀釋濃度分別為1:2500、1:2500、1:5000)孵育,4℃過夜。加羊抗兔二抗(稀釋濃度為1:3000)孵育,常溫2 h。凝膠成像儀掃描結(jié)果后進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS18.0統(tǒng)計軟件,檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間差異的顯著性采用單因素方差分析(檢驗),法進(jìn)行組間的兩兩比較。同組治療前后比較用配對樣本檢驗。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后神經(jīng)功能評分比較

與正常組、假手術(shù)組比較,模型組神經(jīng)功能評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。模型組治療前后神經(jīng)功能評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。針刺組治療前后神經(jīng)功能評分比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。治療后針刺組神經(jīng)功能評分與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠治療前后神經(jīng)功能評分比較 (±s,分)

注:與正常組、假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與同組治療前比較3)＜0.01

2.2 各組大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA表達(dá)比較

與正常組比較,假手術(shù)組Caspase-3、PARP-1的mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05),模型組Caspase-3、PARP-1的mRNA表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。與模型組比較,針刺組Caspase-3的mRNA表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05),針刺組PARP-1的mRNA表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。詳見表3。

2.3 大腦皮層Caspase-3、PARP-1的蛋白表達(dá)結(jié)果

與正常組比較,假手術(shù)組Caspase-3、PARP-1的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05),模型組Caspase-3、PARP-1的蛋白表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。與模型組比較,針刺組Caspase-3、PARP-1的蛋白表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。詳見圖1、表4。

表3 各組大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA表達(dá)量比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

圖1 各組大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的蛋白表達(dá)灰度條帶圖

表4 各組大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的蛋白表達(dá)量比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

4 討論

缺血再灌注以后會出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8-11]。研究表明[12-14],缺血中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的壞死和缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要表現(xiàn)形式。然而,缺血半暗帶的腦組織損傷具有可逆性,有效干預(yù)缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡已然成為研究的契合點[15-16]。本研究結(jié)果證實,針刺內(nèi)關(guān)可下調(diào)缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的表達(dá),從而發(fā)揮缺血再灌注后腦保護(hù)的作用。

半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是Caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路中最重要的蛋白酶,它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征改變有關(guān)的蛋白,從而導(dǎo)致凋亡。其中,Caspase-3是參與凋亡的Caspase級聯(lián)反應(yīng)最終效應(yīng)子,是凋亡過程最重要的蛋白酶,是細(xì)胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[17-19]。研究表明抑制Caspase-3 的活性對缺血性腦損傷具有較明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[7]。

非Caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路機(jī)制是一個繁雜的過程,其中PARP-1/AIF介導(dǎo)的凋亡通路研究諸多[20-23]。多聚ADP核糖聚合酶(PARP-1)是一種DNA修復(fù)酶,參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)。在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑中,PARP-1被Caspase-3和Caspase-7切割為p89和p21兩個片段,抑制其DNA修復(fù)功能[24-27]。然而PARP-1并不僅僅作為死亡底物被動地參與細(xì)胞凋亡,PARP-1過度激活能通過引起線粒體損傷和AIF釋放,誘發(fā)非Caspase依賴性細(xì)胞凋亡[28-29]。

本實驗通過運用Real-time PCR技術(shù)檢測mRNA表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后腦梗死區(qū)域Caspase-3、PARP-1表達(dá)增加,針刺內(nèi)關(guān)、水溝能下調(diào)Caspase-3、PARP-1表達(dá),抑制Caspase-3介導(dǎo)的Caspase依賴性凋亡和PARP-1/AIF介導(dǎo)的非Caspase依賴性凋亡,從而減輕缺血再灌注損傷。

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Effect of Acupuncture at Points Neiguan(PC6) and Shuigou(GV26) on Caspase-3 and PARP-1 Expressions in the Cerebral Cortex in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

-1,-2,1.

1.,310005,; 2.,210023,

To investigate the inhibiting effect of acupuncture at points Neiguan(PC6) andShuigou(GV26) on caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions in the cerebral cortex in rats with cerebral ischemia-reperfusion.Forty male SD rats were randomized to normal, sham operation, model and acupuncture groups. A model of middle cerebral artery infarction was made by modified Longa thread occlusion. Neurological function was scored using a 6-grade 5-point Bederson’s scale. Caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions in rat cerebral cortex were determined using real-time PCR and Western Blot at 24 hrs after cerebral ischemia.Neurological deficit was reduced in the acupuncture group of rats with cerebral ischemia-reperfusion compared with the model group (＜0.01). Acupuncture could down-regulate caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions and there was a statistically significant difference compared with the model group (＜0.05,＜0.01;＜0.05,＜0.05).Acupuncture at points Neiguan and Shuigou can down-regulate caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions in the cerebral cortex in rats with cerebral ischemia-reperfusion.

Acupuncture; Apoptosis; Reperfusion injury; Real-time PC; Western Blot; Caspase-3; PARP-1; Rats

1005-0957(2018)02-0234-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.02.0234

國家自然科學(xué)基金面上項目(81674067);浙江省自然科學(xué)基金一般項目(LY17H270009)

程瑩瑩(1986—),女,住院醫(yī)師,碩士,Email:cyysince@163.com

倪光夏(1964—),男,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,Email:xgn66@163.com

2017-05-20