程瑩瑩,倪光夏,狄忠

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針刺內關、水溝對腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1表達的影響

程瑩瑩1,倪光夏2,狄忠1

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院,杭州 310005;2.南京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,南京 210023)

探討針刺內關、水溝抑制腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1 mRNA和蛋白表達的影響。40只雄性SD大鼠,隨機分為正常組、假手術組、模型組、針刺組。采用改進的Longa線栓法制備大腦中動脈梗塞模型。參考Bederson6級5分法進行神經功能評分,運用Real-time PCR、Western Blot檢測腦缺血后24 h大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA及蛋白表達量變化。與模型組相比,針刺組可改善缺血再灌注大鼠神經功能缺損癥狀(＜0.01);針刺可下調Caspase-3、PARP-1的mRNA及蛋白表達,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05,＜0.01;＜0.05,＜0.05)。針刺內關、水溝可下調腦缺血再灌注大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA及蛋白表達。

針刺;細胞凋亡;再灌注損傷;Real-time PCR;Western Blot;Caspase-3;PARP-1;大鼠

缺血再灌注引起腦組織損傷的機制眾多,神經細胞凋亡是目前研究較多的機制之一,它是梗死周圍區(qū)神經細胞死亡的主要方式[1-4]。腦缺血后介導神經細胞凋亡的通路有Caspase依賴性的內源性線粒體通路和外源性死亡受體通路;非Caspase依賴性凋亡通路[5-6]。本研究通過運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real- time PCR)、蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測mRNA及蛋白表達技術,以Caspase依賴性凋亡通路中Caspase-3、非Caspase依賴性凋亡通路中PARP-1 mRNA及蛋白表達變化為觀察指標,探討針刺抑制急性腦缺血神經細胞凋亡的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及分組

選用上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供的健康成年雄性SPF級SD大鼠40只(合格證號為SCXK2008-0016),體重(260±20)g,隨機分為正常組、假手術組、模型組、針刺組,每組10只。

1.1.2 主要儀器和設備

一次性針灸針,規(guī)格為0.30 mm×25 mm(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);電子天平,CP512型(上海奧豪斯公司);4℃冰箱(西門子公司);VXE380超低溫冰箱(Thermo公司);高速冷凍離心機,KendroBiofuge (Germany生產);電動勻漿器、移液器(EPPendorf公司);紫外可見分光光度計(德國Eppendorf BioPhotometer);基因擴增儀MJ-mini(BIO-RAD公司);實時熒光定量PCR儀(MX3000P,Stratagene公司);超凈工作臺(蘇凈集團);TY-80S脫色搖床(普陽科學儀器研究所);垂直電泳系統(tǒng)、電轉膜儀、制膠器(BIO-RAD公司產品)。

1.1.3 試劑、耗材

水合氯醛(上海國藥集團化學試劑有限公司); Trizol(Invitrogen公司);異丙醇、無水乙醇、氯仿(南京寧試化學試劑有限公司);反轉錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit,Thermo公司);Real- time PCR試劑盒(Promega公司);引物(上海捷瑞生物工程有限公司);BCA法檢測蛋白濃度試劑盒(Thermo公司);封閉蛋白干粉(武漢博士德公司);單克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

采用改進的Longa線栓法[7],SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g體重腹腔注射)麻醉,仰臥固定。頸部正中備皮后切開皮膚,鈍性分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,仔細分離避免損傷迷走神經。結扎頸外動脈遠心端,動脈夾夾閉頸總動脈近心端及頸內動脈,靠近頸總動脈分叉處在頸外動脈上剪一小口,將直徑0.26 mm尼龍釣絲沿小口插入頸總動脈,移去頸內動脈的動脈夾,經頸總動脈分叉處將魚線緩慢向頸內動脈入顱腦方向推進約(18±2)mm,微遇阻力時停止,使魚線頭端到達較細的大腦中動脈起始處。于缺血2 h后拔出栓線,建立缺血再灌注模型。假手術組大鼠只分離暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,結扎頸外動脈;正常組不進行手術處理。

再灌注2 h進行神經行為學評分。評分標準參考Bederson 6級5分法,正常為5級(0分);對側上肢不能完全伸展為4級(1分);向對側推時抵抗力下降為3級(2分);提尾時向對側轉圈為2級(3分);自動轉圈為1級(4分);無自發(fā)性活動、意識障礙為0級(5分)。神經行為學評分達到2～4分視為造模成功,模型成功率大約50%。

1.2.2 干預方法

針刺組取內關(雙)、水溝。根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”選取。在動物模型制備成功1 h后固定大鼠(各組均需固定,除針刺組其他組不進行針刺治療),選用華佗牌0.30 mm×25 mm針灸針進行一次針刺。先針刺雙側內關穴,直刺,行捻轉提插瀉法1 min;繼刺水溝穴,在鼻中隔下部向上斜刺,施雀啄手法刺激10次。

1.2.3 標本處理

確認各組模型已建立。造模后24 h斷頭處死大鼠,置于冰盤快速剝離手術側大腦皮層中段1/3,迅速置于液氮冷凍,稍后移至﹣80℃超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標檢測

1.3.1 大腦皮層總RNA和蛋白的提取

大腦皮層總RNA和蛋白提取具體步驟嚴格按照說明書操作。得到總RNA和蛋白質,﹣80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Real-time PCR檢測mRNA的表達

1.3.2.1 RNA逆轉錄

用紫外分光光度計在260 nm和280 nm波長處測定總RNA溶液的吸光度,進行RNA濃度和純度分析, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性。RNA純度和完整性滿足要求后,采用二步法進行RNA逆轉錄。取樣品RNA 2mg,加入random hexamer primer 1mL,再加入無酶水,使得總體積為11mL,65℃,5 min后放置冰上。加入5X Reaction Buffer 4mL、RiboLock TM RNase Inhibitor(20m/mL)1mL,10 mM dNTP Mix 2mL, M-MuLV Reverse Transcriptase(20m/mL)2mL混勻, 25℃、5 min;37℃、60 min,終止反應,cDNA置﹣20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 引物設計

引物由PubMed中,通過Nucleotide查找獲得,并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列及長度見表1(其中GAPDH為內參)。

表1 基因引物及序列

1.3.2.3 Real-time PCR

以GAPDH為內參,采用SYBR Green熒光染料法。反應體系中包括cDNA 100 ng、Real-time PCR Master Mix 10mL、上下游引物各0.5mL,加無酶水至20mL。反應步驟為95℃預變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火延伸30 s,擴增40個循環(huán);72℃ 1 min。55℃、30 s讀取熒光強度。

1.3.3 Western Blot法檢測蛋白表達

1.3.3.1 BCA法檢測蛋白濃度

根據試劑盒說明書配制標準品和待測樣品,95℃變性5 min,通過分光光度計獲得吸光值。繪制標準曲線并計算出樣品蛋白濃度。

1.3.3.2 Western Blot

定量蛋白濃度后,取20mg溶解在6×loading Buffer中,加入1%SDS定容至20mL,95℃煮沸5 min。蛋白上樣20mL,12%的分離膠、5%濃縮膠電泳。濕法轉印蛋白至PVDF膜上,30 mA,4℃過夜。根據分子量大小將膜裁成3份,分別加兔抗鼠b-actin、Caspase-3、PARP-1一抗(稀釋濃度分別為1:2500、1:2500、1:5000)孵育,4℃過夜。加羊抗兔二抗(稀釋濃度為1:3000)孵育,常溫2 h。凝膠成像儀掃描結果后進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

運用SPSS18.0統(tǒng)計軟件,檢測結果以均數±標準差表示,多組間差異的顯著性采用單因素方差分析(檢驗),法進行組間的兩兩比較。同組治療前后比較用配對樣本檢驗。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠治療前后神經功能評分比較

與正常組、假手術組比較,模型組神經功能評分差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。模型組治療前后神經功能評分比較差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。針刺組治療前后神經功能評分比較差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。治療后針刺組神經功能評分與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠治療前后神經功能評分比較 (±s,分)

注:與正常組、假手術組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與同組治療前比較3)＜0.01

2.2 各組大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA表達比較

與正常組比較,假手術組Caspase-3、PARP-1的mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05),模型組Caspase-3、PARP-1的mRNA表達量差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。與模型組比較,針刺組Caspase-3的mRNA表達量差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05),針刺組PARP-1的mRNA表達量差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。詳見表3。

2.3 大腦皮層Caspase-3、PARP-1的蛋白表達結果

與正常組比較,假手術組Caspase-3、PARP-1的蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(＞0.05),模型組Caspase-3、PARP-1的蛋白表達量差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。與模型組比較,針刺組Caspase-3、PARP-1的蛋白表達量差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。詳見圖1、表4。

表3 各組大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的mRNA表達量比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

圖1 各組大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的蛋白表達灰度條帶圖

表4 各組大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的蛋白表達量比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

4 討論

缺血再灌注以后會出現廣泛的神經細胞凋亡[8-11]。研究表明[12-14],缺血中心區(qū)神經細胞的壞死和缺血半暗帶神經細胞的凋亡是缺血再灌注損傷后神經細胞死亡的主要表現形式。然而,缺血半暗帶的腦組織損傷具有可逆性,有效干預缺血半暗帶區(qū)神經細胞的凋亡已然成為研究的契合點[15-16]。本研究結果證實,針刺內關可下調缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層Caspase-3、PARP-1的表達,從而發(fā)揮缺血再灌注后腦保護的作用。

半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是Caspase依賴性細胞凋亡通路中最重要的蛋白酶,它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征改變有關的蛋白,從而導致凋亡。其中,Caspase-3是參與凋亡的Caspase級聯(lián)反應最終效應子,是凋亡過程最重要的蛋白酶,是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經之路[17-19]。研究表明抑制Caspase-3 的活性對缺血性腦損傷具有較明顯的神經保護作用[7]。

非Caspase依賴性細胞凋亡通路機制是一個繁雜的過程,其中PARP-1/AIF介導的凋亡通路研究諸多[20-23]。多聚ADP核糖聚合酶(PARP-1)是一種DNA修復酶,參與DNA的復制、轉錄和修復。在經典的細胞凋亡途徑中,PARP-1被Caspase-3和Caspase-7切割為p89和p21兩個片段,抑制其DNA修復功能[24-27]。然而PARP-1并不僅僅作為死亡底物被動地參與細胞凋亡,PARP-1過度激活能通過引起線粒體損傷和AIF釋放,誘發(fā)非Caspase依賴性細胞凋亡[28-29]。

本實驗通過運用Real-time PCR技術檢測mRNA表達變化,發(fā)現缺血再灌注后腦梗死區(qū)域Caspase-3、PARP-1表達增加,針刺內關、水溝能下調Caspase-3、PARP-1表達,抑制Caspase-3介導的Caspase依賴性凋亡和PARP-1/AIF介導的非Caspase依賴性凋亡,從而減輕缺血再灌注損傷。

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Effect of Acupuncture at Points Neiguan(PC6) and Shuigou(GV26) on Caspase-3 and PARP-1 Expressions in the Cerebral Cortex in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

-1,-2,1.

1.,310005,; 2.,210023,

To investigate the inhibiting effect of acupuncture at points Neiguan(PC6) andShuigou(GV26) on caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions in the cerebral cortex in rats with cerebral ischemia-reperfusion.Forty male SD rats were randomized to normal, sham operation, model and acupuncture groups. A model of middle cerebral artery infarction was made by modified Longa thread occlusion. Neurological function was scored using a 6-grade 5-point Bederson’s scale. Caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions in rat cerebral cortex were determined using real-time PCR and Western Blot at 24 hrs after cerebral ischemia.Neurological deficit was reduced in the acupuncture group of rats with cerebral ischemia-reperfusion compared with the model group (＜0.01). Acupuncture could down-regulate caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions and there was a statistically significant difference compared with the model group (＜0.05,＜0.01;＜0.05,＜0.05).Acupuncture at points Neiguan and Shuigou can down-regulate caspase-3, and PARP-1 mRNA and protein expressions in the cerebral cortex in rats with cerebral ischemia-reperfusion.

Acupuncture; Apoptosis; Reperfusion injury; Real-time PC; Western Blot; Caspase-3; PARP-1; Rats

1005-0957(2018)02-0234-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.02.0234

國家自然科學基金面上項目(81674067);浙江省自然科學基金一般項目(LY17H270009)

程瑩瑩(1986—),女,住院醫(yī)師,碩士,Email:cyysince@163.com

倪光夏(1964—),男,主任醫(yī)師,博士生導師,Email:xgn66@163.com

2017-05-20