張小花 ，申 劍，武權(quán)生△，蘇珊珊

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000;2桓臺(tái)縣中醫(yī)院

武權(quán)生教授是甘肅省名中醫(yī)，在長期醫(yī)療實(shí)踐中積累了豐富的治療乳腺增生病(hyperplasia of mammary gland，HMG)的經(jīng)驗(yàn)，在臨床上尤其擅長用疏肝散結(jié)、補(bǔ)腎柔肝周期療法治療HMG［1］。本研究旨在探討武權(quán)生教授周期療法治療HMG的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級3～4月齡、健康雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001-62001000000069。

1.2 主要試劑、藥品 苯甲酸雌二醇注射液(杭州動(dòng)物藥品廠，批號(hào)：140429)；生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1206191101)；黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：130702)；三苯氧胺(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：14042911)；逍遙丸(蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)：14A28)；中藥(Ⅰ號(hào)方藥物組成：柴胡、赤芍、枳實(shí)、川楝子、夏枯草、白蒺藜、全瓜蔞、鱉甲、王不留行、當(dāng)歸、生地黃、海藻、昆布；Ⅱ號(hào)方藥物組成：柴胡、醋香附、延胡索、王不留行、川楝子、夏枯草、當(dāng)歸、杭白芍、海藻、昆布、何首烏、菟絲子、肉蓯蓉、巴戟天、知母、黃柏)。以上藥物均購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科；兔抗鼠細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體(編號(hào)：ZS-940，批號(hào)：G0110)，兔抗鼠雌激素受體(ER)抗體(編號(hào)：ZS-5420，批號(hào)：23546)，兔抗鼠孕激素受體(PR)抗體(編號(hào)：ZS-5380，批號(hào)：23546)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 從90只大鼠中隨機(jī)抽取20只，為空白組，右下肢肌肉注射生理鹽水注射液0.2 mL/(kg·d)，共30天。其余70只大鼠進(jìn)行造模［2］：大鼠右下肢每日肌注苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/(kg·d)，25天后，改為肌肉注射黃體酮注射液4.5 mg/(kg·d)，共5天。實(shí)驗(yàn)第31天隨機(jī)從造模組和空白組中分別抽取10只大鼠，脫臼處死，楔形取下第3對左側(cè)乳房，置于10%的甲醛溶液中固定，包埋切片，HE染色后在光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，觀測造模是否成功。造模成功后將60只大鼠按灌服藥物不同隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為模型組、逍遙丸組、三苯氧胺組及中藥低、中、高劑量組?？瞻捉M和模型組給予生理鹽水0.2 mL/(kg·d)灌胃，其余5組灌胃藥物劑量根據(jù)人與動(dòng)物每公斤體質(zhì)量劑量換算系數(shù)表換算。其中逍遙丸組灌服逍遙丸混懸液0.8 g/(kg·d)；三苯氧胺組灌服三苯氧胺水溶劑3.6 mg/(kg·d)；中藥組先灌服Ⅰ號(hào)方10天，低、中、高劑量組分別為11.1、22.2、44.4 g/(kg·d)，后灌服Ⅱ號(hào)方 20 天，低、中、高劑量組分別為9.6、19.2、38.4 g/(kg·d)。

1.4 觀察指標(biāo) 分別于造模后、灌服Ⅰ號(hào)方10天后、灌服Ⅱ號(hào)方20天后測量大鼠第3對乳房左側(cè)乳頭的直徑。末次灌胃24小時(shí)后脫臼處死大鼠，無菌操作楔形取下大鼠第3對左側(cè)乳房，用10%中性甲醛溶液固定后分別進(jìn)行病理切片，免疫組化法檢測ER、PR、ERK陽性表達(dá)。免疫組化法檢測 ER、PR、ERK 陽性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］：乳腺的導(dǎo)管及小葉上皮細(xì)胞的核和/或胞漿呈現(xiàn)棕黃色著色時(shí)判為陽性。未見陽性細(xì)胞表達(dá)計(jì)為(-)；陽性細(xì)胞數(shù)小于總數(shù)的20%，而局部見少量較強(qiáng)著色的陽性細(xì)胞計(jì)為(±)；若陽性細(xì)胞率大于20%，依據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)目由少到多、著色由淺到深依次計(jì)為(+)(++)(+++)(++++)。計(jì)算陽性率時(shí)將(±)計(jì)入陽性范圍；(-)(±)(+)(++)(+++)(++++)，分別計(jì)為0、1、2、3、4、5 分，其積分值越高，則 ER、PR、ERK 含量越高。試驗(yàn)期間所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，室溫24～27℃，相對濕度為 49%～61%，通風(fēng)良好，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 與空白組大鼠相比，造模第12天起其余各組大鼠開始出現(xiàn)喜聚集、毛發(fā)粗糙、具有攻擊性、乳房色紅，造模結(jié)束后出現(xiàn)精神不振、爪涼、易激惹、乳房色紅、透毛可見；用藥后上述表現(xiàn)不同程度好轉(zhuǎn)，活動(dòng)增加，易激惹、乳房紅腫現(xiàn)象基本消失。造模后，各造模組大鼠的乳頭直徑與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各造模組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；灌服Ⅰ號(hào)方10天后各用藥組大鼠乳頭直徑縮小，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各造模組間比較無明顯差異(P＞0.05)；灌服Ⅱ號(hào)方20天后大鼠乳頭直徑進(jìn)一步縮小，除中藥高劑量組外，其余各組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各用藥組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠乳頭直徑變化情況(±s) m m

表1 各組大鼠乳頭直徑變化情況(±s) m m

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 造模后乳頭直徑 灌服Ⅰ方后乳頭直徑 灌服Ⅱ方后乳頭直徑空白組 10 0.83±0.13* 0.98±0.14* 0.92±0.09*模型組 10 1.67±0.15# 1.32±0.13# 1.33±0.13#三苯氧胺組 10 1.65±0.18# 1.28±0.09# 1.10±0.08#*逍遙丸組 10 1.67±0.13# 1.36±0.20# 1.14±0.15#*中藥低劑量組 10 1.59±0.12# 1.20±0.16# 1.09±0.11#*中藥中劑量組 10 1.65±0.22# 1.22±0.16# 1.04±0.08#*中藥高劑量組 10 1.58±0.17# 1.26±0.20# 0.90±0.09*

2.2 乳腺組織ER、PR、ERK表達(dá)強(qiáng)度 各組大鼠乳腺ER表達(dá)積分與模型組比較均較低，其中以空白組、中藥中劑量組最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；除空白組、中藥中劑量組外，其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠乳腺PR表達(dá)積分與模型組比較降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；除模型組外其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR表達(dá)積分情況(±s)分

表2 各組大鼠乳腺組織ER、PR表達(dá)積分情況(±s)分

注：*表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) ER PR空白組 10 1.20±0.83* 1.80±0.84*模型組 10 4.00±1.00 4.00±1.00三苯氧胺組 10 2.00±1.22 2.20±1.30*逍遙丸組 10 2.40±0.55 2.40±0.55*中藥低劑量組 10 1.80±1.64 1.60±1.34*中藥中劑量組 10 1.20±0.45* 1.80±0.84*中藥高劑量組 10 2.60±1.81 1.60±0.55*

2.3 乳腺組織ERK表達(dá)強(qiáng)度 與模型組比較，各組大鼠乳腺ERK表達(dá)積分均降低，其中以空白組、中藥高劑量組最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與三苯氧胺組比較，中藥高劑量組ERK表達(dá)積分較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠乳腺組織ERK積分值(±s) 分

表3 各組大鼠乳腺組織ERK積分值(±s) 分

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與三苯氧胺組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) ERK空白組 10 1.90±0.74*模型組 10 3.60±1.17三苯氧胺組 10 2.80±0.79逍遙丸組 10 2.60±0.84中藥低劑量組 10 2.10±0.99中藥中劑量組 10 2.30±0.48中藥高劑量組 10 1.90±0.99*△

3 討論

HMG是一種非炎非瘤的增生性病變，與內(nèi)分泌紊亂關(guān)系密切，其基本病理變化是乳腺的腺泡、導(dǎo)管及纖維結(jié)締組織的增生［4］。HMG的發(fā)病可以從青春期至絕經(jīng)期的任一年齡，其中以25～45歲多見，35～45歲為高峰年齡，約占全部乳腺疾病的70%以上。中醫(yī)稱其為“乳癖”，沖任失調(diào)，肝郁腎虛為發(fā)病之本，血瘀氣滯痰凝為發(fā)病之標(biāo)，屬本虛標(biāo)實(shí)，與肝、脾、腎 3臟［5］密切相關(guān)，其癥狀常在月經(jīng)前明顯加重。

在臨床診療中，武權(quán)生教授依據(jù)月經(jīng)節(jié)律沖任、胞宮氣血由滿盈、溢瀉至空虛的變化和本病隨月經(jīng)周期發(fā)作的特點(diǎn)而分段周期論治。強(qiáng)調(diào)“經(jīng)前勿補(bǔ)，經(jīng)后勿瀉”的原則，認(rèn)為經(jīng)前血海充盈，宜疏導(dǎo)；經(jīng)后血?？仗?，宜調(diào)補(bǔ)。因此，針對乳腺增生病在月經(jīng)的不同時(shí)期制定了不同的中藥處方：Ⅰ號(hào)方重用柴胡疏肝解郁，枳實(shí)理氣解郁，泄熱破結(jié)，二者共為君藥，疏肝散結(jié)為主，一升一降，加強(qiáng)舒暢肝氣之功，肝氣舒，結(jié)塊散，乳痛消；川楝子理氣止痛，白蒺藜疏肝解郁，二藥相伍，疏肝解郁和胃；鱉甲、昆布、海藻軟堅(jiān)散結(jié)共為臣藥，疏肝解郁，軟堅(jiān)散結(jié)；當(dāng)歸、王不留行活血消腫；夏枯草、全瓜蔞散結(jié)消腫清熱，共為佐使，諸藥合用，共奏疏肝清熱、軟堅(jiān)散結(jié)之效。Ⅱ號(hào)方中菟絲子、巴戟天、肉蓯蓉補(bǔ)腎陽亦能調(diào)補(bǔ)沖任，三者共為君藥，腎氣健，肝氣平，則沖任調(diào)；白芍調(diào)沖任；當(dāng)歸甘溫而潤，養(yǎng)血活血，白芍配當(dāng)歸活血調(diào)經(jīng)，養(yǎng)陰柔肝；柴胡、醋香附、川楝子疏肝解郁；知母、黃柏滋腎陰，共為臣藥，補(bǔ)腎柔肝，又肝腎同源，腎氣腎精充足則肝主疏泄的功能得以更好發(fā)揮；海藻、昆布、夏枯草散結(jié)消腫；何首烏補(bǔ)益精血，配夏枯草散結(jié)消腫；元胡活血化瘀、理氣止痛；王不留行活血通經(jīng)，行血脈，共為佐使，散結(jié)消腫，活血止痛；全方共奏疏肝、補(bǔ)腎柔肝、調(diào)補(bǔ)沖任之效。兩方抓住HMG肝氣郁結(jié)，痰凝血瘀，沖任失調(diào)的病機(jī)，配伍精當(dāng)，根據(jù)HMG的病理特點(diǎn)，攻補(bǔ)兼施，標(biāo)本兼治而不失側(cè)重。

婦女正常乳腺中的雌、孕激素受體高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)病率升高有關(guān)［6］，更有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳腺組織從正常到增生終至癌變的過程中，ER的陽性表達(dá)量呈漸進(jìn)性［7］。ERK2mRNA在乳腺病中表達(dá)由強(qiáng)到弱分別為乳腺癌、非典型增生、良性增生、正常乳腺，說明ERK2在乳腺癌發(fā)生的整個(gè)過程中為活化狀態(tài)，與乳腺增生的發(fā)病有關(guān)［8］。本研究表明，乳腺增生大鼠ER、PR、ERK含量明顯升高，而周期治療可抑制雌、孕激素受體的表達(dá)，減弱雌、孕激素對靶細(xì)胞的敏感性，從而達(dá)到治療乳腺增生的目的。

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