曹艷春+趙振利

摘要：以夏蠟梅幼嫩葉片為材料進行組織培養(yǎng)，研究建立其體外植株再生體系。結(jié)果表明，夏蠟梅葉片愈傷組織、芽、根誘導的最適培養(yǎng)基分別為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、1/2MS+0.3 mg/L NAA，這為夏蠟梅的快速繁殖及工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：夏蠟梅；體外植株；培養(yǎng)基；再生；愈傷組織

中圖分類號： S685.990.4+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0039-02

夏蠟梅（Calycanthus chinensis Cheng et S. Y. Chang）為蠟梅科夏蠟梅屬落葉灌木，是國家二級保護植物，其花形奇特、色彩淡雅，觀賞價值高，是一種在園林綠地中常用的花灌木。夏蠟梅初開之花有解暑、清熱、理氣、止咳等功效，花、根可治胃痛，葉含有揮發(fā)性的芳香油，因此，夏蠟梅具有廣闊的開發(fā)利用前景。目前，生產(chǎn)上夏蠟梅主要靠種子繁殖，由于其繁殖率低、育苗周期長，根本滿足不了生產(chǎn)和科研需要，而國內(nèi)外對夏蠟梅的研究主要集中在營養(yǎng)器官解剖、逆境脅迫對幼苗生理生態(tài)特性的影響等[1-4]，利用莖段進行組織培養(yǎng)的研究相對較少[5-6]，且存在繁殖系數(shù)低、組培系統(tǒng)不完善等問題。本研究利用夏蠟梅幼苗葉片，通過篩選其組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑種類、水平及使用比例，建立其高效的體外植株再生體系，為其新品種培育、分子生物學研究和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

2年生夏蠟梅健康植株，由河南省中牟縣白沙鎮(zhèn)蠟梅資源圃提供，取其幼嫩葉片作為外植體進行組織培養(yǎng)，建立體外植株再生體系。

1.2試驗方法

1.2.1夏蠟梅外植體的預培養(yǎng)將采集的夏蠟梅幼嫩葉片用75%乙醇（酒精）消毒30 s，無菌水清洗3次；用0.1%氯化汞消毒5 min，用無菌水清洗3次；接種于含有植物激素的MS基本培養(yǎng)基（含蔗糖20 g/L、瓊脂粉4.6 g/L）上，在溫度為 25±2 ℃、光照強度為130 μmol/（m2·s）、光照時間為16 h/d的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。組織培養(yǎng)條件下同。

1.2.2夏蠟梅葉片愈傷組織的誘導以MS為基本培養(yǎng)基（蔗糖質(zhì)量濃度為20 g/L、瓊脂粉質(zhì)量濃度為4.6 g/L、聚乙烯吡咯烷酮質(zhì)量濃度為1.5 g/L），分別添加濃度梯度為0.1、0.3、0.5、0.7、1.1 mg/L的萘乙酸（NAA）和濃度梯度為2、4、6、8、10 mg/L的6-芐基腺嘌呤（6-6-BA，簡稱6-BA）；將夏蠟梅預培養(yǎng)的葉片切成約1.0 cm×1.0 cm的小塊，接種于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)進行愈傷組織的誘導，每組合20瓶，每瓶3個外植體；每隔10 d統(tǒng)計1次愈傷組織誘導率，第50天時根據(jù)愈傷組織誘導率的大小確定葉片愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基。愈傷組織誘導率=（誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

1.2.3夏蠟梅芽的誘導將誘導產(chǎn)生的夏蠟梅愈傷組織，接種到MS添加不同濃度NAA、6-BA的芽誘導培養(yǎng)基上，NAA、6-BA濃度設(shè)置與愈傷組織誘導相同，培養(yǎng)室內(nèi)進行芽的誘導培養(yǎng)，每組合20瓶，每瓶3塊；第30天時觀察芽的分化情況，以誘導出的芽肉眼可清晰分辨為標準，計算芽的誘導率，確定芽誘導的最適培養(yǎng)基。芽誘導率=（誘導出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

1.2.4夏蠟梅根的誘導誘導出的芽長到約3 cm高時，從莖基部剪下，轉(zhuǎn)接到添加濃度梯度為0.1、0.3、0.5 mg/L NAA的1/2 MS生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，觀察生根情況，第20天時統(tǒng)計其生根率，篩選出夏蠟梅根誘導的最適培養(yǎng)基。根誘導率=（生根的幼芽數(shù)/接種的幼芽總數(shù)）×100%。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用LSR法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素組合對夏蠟梅葉片愈傷組織誘導的影響

由表1可見，不同激素組合培養(yǎng)基對夏蠟梅葉片愈傷組織（圖1-A）的誘導差異明顯；NAA質(zhì)量濃度為0.1～1.1 mg/L 時，隨6-BA濃度的升高，夏蠟梅葉片愈傷組織的誘導率逐漸減小，其中，NAA質(zhì)量濃度為0.9～1.1 mg/L時，隨6-BA質(zhì)量濃度的升高，夏蠟梅葉片愈傷組織的褐化情況逐漸加重；培養(yǎng)基為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA時，夏蠟梅葉片愈傷組織的誘導率相對最大，為100.00%，該培養(yǎng)基作為夏蠟梅葉片愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基。

2.2不同激素組合對夏蠟梅芽誘導的影響

由表1可見，NAA質(zhì)量濃度為0.5～1.1 mg/L時，隨 6-BA 質(zhì)量濃度的升高，葉片芽誘導率逐漸減小，其中，培養(yǎng)基組合為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA時芽的誘導率相對最大，為59.67%，說明夏蠟梅愈傷組織芽誘導（圖1-B）的最適培養(yǎng)基為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA。

2.3不同激素濃度對夏蠟梅根誘導的影響

由表2可見，夏蠟梅芽在沒有添加NAA的1/2MS培養(yǎng)基上也可誘導出根（圖1-C），生根率為100.00%，但誘導出根的條數(shù)相對較少，為3條；培養(yǎng)基1/2MS+0.3 mg/L NAA誘導出根的條數(shù)相對最多、根長相對相對最長，分別為6條、3.0 cm，并可形成完整植株（圖1-D），可作為夏蠟梅生根的最適培養(yǎng)基。

3結(jié)論與討論

植物體外植株再生與植物品種、基因型和培養(yǎng)條件密切相關(guān)。一般情況下，植物基因型在分類學中的親緣關(guān)系越遠，體外植株再生體系所需植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度差異就越大[7-9]。前人用夏蠟梅莖段培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，莖段在培養(yǎng)過程中周圍培養(yǎng)基有變綠現(xiàn)象，可能為葉綠體的滲透，同時隨培養(yǎng)時間的增長，莖段上皮孔增大，有粉末狀物質(zhì)溢出，影響芽的增殖和分化[5]。本研究以夏蠟梅幼嫩葉片為材料，在基本培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，篩選出愈傷組織、芽、根誘導的適宜培養(yǎng)基組合分別為MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、MS+0.9 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA、1/2MS+0.3 mg/L NAA。研究中發(fā)現(xiàn)，當NAA質(zhì)量濃度一致時，隨 6-BA 質(zhì)量濃度的升高，夏蠟梅愈傷組織的誘導率呈下降趨勢，這與張變莉等結(jié)論[10-11]吻合；加入NAA對根誘導有一定的促進作用，能夠增加根的數(shù)量，提高根的質(zhì)量。

參考文獻：

[1]陳模舜，柯世省. 瀕危植物夏蠟梅營養(yǎng)器官的解剖結(jié)構(gòu)特征[J]. 植物資源與環(huán)境學報，2010，19（3）：37-41.

[2]汪瓊，史云云，姚青菊，等. 夏蠟梅和美國蠟梅及屬間雜種“紅運”營養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)特征比較[J]. 植物資源與環(huán)境學報，2011，20（3）：62-68.

[3]彭禮瓊，金則新，王強. 模擬酸雨對瀕危物種夏蠟梅幼苗生理生態(tài)特性的影響[J]. 植物研究，2013，33（2）：202-207.

[4]朱琳，蘆建國. 干旱脅迫對夏蠟梅幼苗生理特征的影響[J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2015，39（2）：179-182.

[5]邵果園，蔡榮榮，王力超，等. 夏蠟梅組織培養(yǎng)試驗初報[J]. 浙江林業(yè)科技，2006，26（5）：28-30.

[6]顧福根，萬志剛，孫丙耀，等. 夏蠟梅的離體培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 園藝學報，2007，34（4）：324.

[7]Bergmann B A，Heungkyu M. In vitro adventitious shoot production in Paulownia[J]. Plant Cell Reports，1997，16（5）：315-319.

[8]Fan G Q，Zhai X Q，Zhai C J，et al. Callus induction from leaves of different Paulownia species and its plantlet regeneration[J]. Journal of Forestry Research，2001，12（4）：209-214.

[9]佘茂云，殷桂香，趙佩，等. 植物組織培養(yǎng)過程中器官發(fā)生途徑再生植株分子機制研究進展[J]. 科技導報，2015，33（2）：91-98.

[10]張變莉，王楊，劉榮寧，等. 同源四倍體臺灣泡桐體外植株再生系統(tǒng)的建立[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學，2015，44（7）：119-123.

[11]翟曉巧，聶琳，張曉申. 灰楸體外植株再生體系建立[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，2011，23（3）：17-19.endprint