馬紅艷，楊明月，徐延森，王平，李秀清，鞠英博，孫杰，杜文雅，張志剛

（滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專院區(qū)a.病理科，b.肝膽科，河北 滄州 061000）

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和高病死率對(duì)女性的身心健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅［1］。 新 輔 助 化 療 （neoadjuvant chemotherapy，NAC）也稱術(shù)前化療，作為乳腺癌綜合治療策略中的重要組成部分，已廣泛應(yīng)用于局部晚期和早期乳腺癌，可以提高手術(shù)切除率和保乳率［2］。乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cell，BCSC）是乳腺癌中具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細(xì)胞，其對(duì)放化療具有一定的抵抗作用，因此乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中起著重要的作用［3］。除了 CD44＋／CD24－表型為乳腺癌干細(xì)胞的特異性表型標(biāo)志外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶 1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）不僅與乳腺癌患者的預(yù)后和耐藥有關(guān)，還可作為乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物，影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［4-5］。本研究旨在探究 NAC前后乳腺癌CD44＋／CD24－與ALDH1＋表型重疊表達(dá)的比例變化，并分析化療前 ALDH1＋／CD44＋／CD24－表型與乳腺癌臨床病理特征及化療效果的關(guān)系，為臨床治療乳腺癌提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取滄州市人民醫(yī)院醫(yī)專院區(qū)2013年1月—2015年12月收治的經(jīng)巴德槍粗針穿刺活檢明確病理診斷的女性初治乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者153例，年齡27～65歲，中位年齡48歲，臨床Ⅱa～Ⅲb期，其中Ⅱ期75例，Ⅲ期78例。術(shù)前化療用藥：紫杉醇175 mg·m－2或多西他賽 75 mg·m－2，表柔比星 60 mg· m－2，或吡柔比星，環(huán)磷酰胺 500 mg·m－2，5-氟尿嘧啶 500 mg·m－2，第1天持續(xù)靜脈滴注。所有方案均3周為一個(gè)化療周期，連用3個(gè)周期。術(shù)中留取新鮮組織標(biāo)本，液氮凍存并保存在－80℃冰箱。收集所有患者的臨床病理資料，并將術(shù)前針吸標(biāo)本和術(shù)后標(biāo)本的存檔石蠟包埋組織塊行4μm厚的組織切片。該研究已經(jīng)通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)方法 ALDH1兔抗人單克隆抗體（abcam，ab52492，1∶100），CD44鼠抗人單克隆抗體（abcam，ab51037，1∶50），CD24兔抗人單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0528R，1∶100），免疫組化檢測(cè)試劑盒 PV-9000及 Polymer雙染檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。操作步驟均參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 染色結(jié)果判定 由2名富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判定。ALDH1單染結(jié)果的判定參照王利平等［6］的方法，每張片子隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察評(píng)分，然后取平均值，免疫組化的最后評(píng)判結(jié)果為陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積，然后對(duì)應(yīng)相應(yīng)的等級(jí)。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：－；1分：＋；2分：＋＋，；3分：＋＋＋。陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分：陽(yáng)性細(xì)胞比例 ＜25%，；2分：26% ～50%；3分：51%～75%；4分：陽(yáng)性細(xì)胞比例＞75%。最后結(jié)果為，0～3分：－；4～5分：＋；6～7分：＋＋；8分以上：＋＋＋。其中－為陰性表達(dá)，＋～＋＋＋為陽(yáng)性表達(dá)。CD44／CD24雙染結(jié)果的判定參照曾妮等［7］的方法進(jìn)行判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：CD44陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜棕黃色，CD24陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)紅色，雙染結(jié)果細(xì)胞膜呈棕黃色胞質(zhì)或胞膜無(wú)紅色信號(hào)干擾的細(xì)胞鑒定為 CD44＋／CD24－。結(jié)果：無(wú) CD44＋／CD24－細(xì)胞為0分；CD44＋／CD24－細(xì)胞比例為 1% ～＜10%：1分；CD44＋／CD24－細(xì)胞比例為 10% ～＜50%：2分；CD44＋／CD24－細(xì)胞比例為 50% ～＜75%：3分；CD44＋／CD24－細(xì)胞比例為75%～100%：4分。最終將0分視為 CD44＋／CD24－表型陰性，≥1分視為CD44＋／CD24－表型陽(yáng)性。綜合同一組織標(biāo)本的ALDH1單染結(jié)果及CD44／CD24的雙染結(jié)果，將同時(shí)具有 ALDH1＋和 CD44＋／CD24－表 型 的 標(biāo) 本 視 為CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型陽(yáng)性，其余為陰性。

1.4 療效評(píng)價(jià) 參照世界衛(wèi)生組織（WHO）實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)療效進(jìn)行評(píng)價(jià)：臨床完全緩解（cCR），病理完全緩解（pCR），部分緩解（cPR），穩(wěn)定（SD），進(jìn)展（PD），cCR＋pCR為有效，SD＋PD為無(wú)效。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用的方法主要為χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1和 CD44／CD24在乳腺癌組織中的表達(dá)情況 ALDH1蛋白在乳腺癌組織細(xì)胞中的著色部位為細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色，CD44陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜棕黃色：CD24陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)紅色，雙染結(jié)果為CD44＋／CD24－表型時(shí)細(xì)胞膜呈棕黃色胞質(zhì)或胞膜無(wú)紅色信號(hào)干擾。

2.2 NAC前后乳腺癌組織標(biāo)本中CD44／CD24／ALDH1的表達(dá)情況 NAC前，乳腺癌組織中ALDH1＋表型的比例為23.5%，CD44＋／CD24－表型的比例為40%；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例為7.2%；NAC后乳腺癌組織中ALDH1＋表型的比例為43.8%，CD44＋／CD24－表型的比例為75.8%；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例為22.9%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，NAC后 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例均較化療前均有顯著升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 NAC前ALDH1和CD44／CD24的表達(dá)情況與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 NAC前ALDH1的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、脈管癌栓、雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、絕經(jīng)狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44／CD24的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、ER、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、絕經(jīng)狀況、PR無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的表達(dá)與腫瘤大小、脈管癌栓、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、絕經(jīng)狀況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 NAC前乳腺癌組織標(biāo)本中CD44／CD24／ALDH1的表達(dá)與化療療效的關(guān)系 NAC前，乳腺癌組織中ALDH1的表達(dá)與NAC效果無(wú)顯著相關(guān)性（χ2＝0.618，P＝0.432）；CD44＋／CD24－表型與NAC效果也無(wú)顯著相關(guān)性（χ2＝2.399，P＝0.121）；而CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型與 NAC效果存在顯著相關(guān)性，且 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型能提示患者良好的預(yù)后（χ2＝5.748，P＝0.017）。見(jiàn)表3。

表1 NAC前后乳腺癌組織標(biāo)本中 CD44、CD24、ALDH1的表達(dá)情況／［n＝153，例（%）］

表2 NAC前CD44、CD24、ALDH1的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系（n＝153，例）

表3 NAC前乳腺癌組織標(biāo)本中CD44、CD24、ALDH1的表達(dá)與化療療效的關(guān)系／［n＝153，例（%）］

3 討論

乳腺癌是全球范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的女性腫瘤之一，已經(jīng)成為一個(gè)非常嚴(yán)重的危害公眾健康的問(wèn)題［8］。盡管有報(bào)道顯示在發(fā)達(dá)國(guó)家乳腺癌5年生存率已經(jīng)明顯提高，但是乳腺癌仍為美國(guó)第二大致死性腫瘤［8］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)2016年約有249 000例新確診乳腺癌患者，預(yù)計(jì)因乳腺癌而死亡的患者數(shù)量將達(dá)到40 500例［8］。在發(fā)展中國(guó)家，乳腺癌患者的5年生存率大約為50%～60%［9］。目前乳腺癌的治療方法主要有手術(shù)切除、放療、輔助性內(nèi)分泌治療、化療等，而NAC的應(yīng)用也越來(lái)越受到大家的重視［9］。研究表明，NAC能夠在術(shù)前減少局部晚期乳腺癌的腫瘤細(xì)胞活性，減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)并減少腫瘤耐藥的發(fā)生，從而為后續(xù)的手術(shù)治療創(chuàng)造條件，增加保乳機(jī)會(huì)同時(shí)減少了手術(shù)的難度和并發(fā)癥的發(fā)生［6，10］。此外，NAC還可以用來(lái)評(píng)估乳腺癌患者的腫瘤化療敏感性，以便后續(xù)治療時(shí)及時(shí)調(diào)整治療策略和方案［2，11］。盡管目前乳腺癌的診療手段已經(jīng)取得了一定的進(jìn)步，但是乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量的狀況仍然不容樂(lè)觀。因此，尋找新的臨床有效的診治乳腺癌的策略是當(dāng)前非常緊要的任務(wù)之一。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中具有自我更新、多向分化以及導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一群細(xì)胞，近年來(lái)關(guān)于乳腺癌干細(xì)胞（BCSCs）的研究也日益增多［12-13］。由于乳腺癌中可能存在一定比例的乳腺癌干細(xì)胞，使得乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，從而導(dǎo)致乳腺癌患者的預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)，作為乳腺癌干細(xì)胞的特異性表型標(biāo)志之一，CD44＋／CD24－可以預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后［14-15］。ALDH1是一種細(xì)胞溶質(zhì)酶，不僅與組織和器官的分化和基因的表達(dá)相關(guān)，還可作為腫瘤干細(xì)胞包括乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［15］。雖然目前關(guān)于ALDH1＋和 CD44＋／CD24－這兩種不同類型的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)情況的研究以及對(duì)化療的反應(yīng)情況的研究較多，但是尚存在一定的爭(zhēng)議［15-18］。如楊俊娥［16］研究發(fā)現(xiàn)，化療會(huì)導(dǎo)致乳腺癌組織中ALDH1＋表型增加；魏素菊等［17］研究發(fā)現(xiàn)化療可使乳腺癌患者外周血中CD44＋CD24－／low細(xì)胞含量降低；而韋偉研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的外周血中CD44＋CD24－／low表型的乳腺癌干細(xì)胞比例經(jīng)化療藥物的刺激后明顯上調(diào)［18］。再者，目前關(guān)于兩者在乳腺癌組織中的重疊表達(dá)情況以及其與化療之間的相關(guān)性的研究尚比較罕見(jiàn)。因此，我們開(kāi)展了此次研究。

本研究首先應(yīng)用免疫組化單染和雙染的方法分別檢測(cè)了ALDH1＋和CD44＋／CD24－兩種表型在NAC前后乳腺癌組織細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ALDH1蛋白在乳腺癌組織細(xì)胞中的著色部位為細(xì)胞質(zhì)，ALDH1＋表型的細(xì)胞染色為棕黃色，CD44陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞膜棕黃色：CD24陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)紅色，雙染結(jié)果為 CD44＋／CD24－表型的細(xì)胞膜呈棕黃色胞質(zhì)或胞膜無(wú)紅色信號(hào)干擾。

接著，我們對(duì)153例患者的乳腺癌組織中ALDH1＋、CD44＋／CD24－和 CD44＋／CD24－／ALDH1＋三種表型的細(xì)胞染色情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析和比較。我 們 發(fā) 現(xiàn)，NAC 后 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的比例均較 NAC前顯著升高，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié) 果 說(shuō) 明，ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的表達(dá)與NAC具有相關(guān)性，且NAC可以促進(jìn)這三種表型的乳腺癌干細(xì)胞比例增加。而這種NAC后乳腺癌干細(xì)胞富集狀態(tài)的出現(xiàn)可能是由于乳腺癌干細(xì)胞多處于細(xì)胞增殖的靜止期即未進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，而絕大多數(shù)的化療藥物一般都是作用于處于增殖周期的腫瘤細(xì)胞，從而使得 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的乳腺癌干細(xì)胞細(xì)胞可以逃避化療藥物的作用，表現(xiàn)出對(duì)化療藥物的抵抗性。

為了探究 NAC前 ALDH1＋、CD44＋／CD24－表型重疊表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征間的關(guān)系，我們分 別 統(tǒng) 計(jì) 分 析 了 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋三種表型分別于乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、脈管癌栓、ER、PR有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、絕經(jīng)狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44／CD24的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓、ER、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、絕經(jīng)狀況、PR無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）；CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型的表達(dá)與腫瘤大小、脈管癌栓、HER-2有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、絕經(jīng)狀況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。說(shuō)明 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有一定的相關(guān)性，即 CD44＋／CD24－／ALDH1＋的表型可能可以用來(lái)預(yù)測(cè)患者臨床預(yù)后及治療的指標(biāo)。

為了探究 NAC前乳腺癌干細(xì)胞中 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型是否可以用來(lái)預(yù)測(cè)NAC的效果，我 們 對(duì) 表 型 為 ALDH1＋、CD44＋／CD24－、CD44＋／CD24－／ALDH1＋的化療效果分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC前，乳腺癌組織中ALDH1的表達(dá)及CD44＋／CD24－表型與NAC效果均無(wú)顯著相關(guān)性；而 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型與 NAC效果存在顯著相關(guān)性，且 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型比例越高，患者的化療效果越好。上述結(jié)果表明，CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型可能可以作為預(yù)測(cè)患者化療效果的臨床指標(biāo)，而具體作用及機(jī)制尚待進(jìn)一步更深入的實(shí)驗(yàn)加以探究證實(shí)。

綜上，NAC可以促進(jìn)乳腺癌組織中 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表 型 比 例 的 增 加，而 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型可以增加患者的化療效果的有效率，因此 CD44＋／CD24－／ALDH1＋表型監(jiān)測(cè)有望成為判斷乳腺癌患者預(yù)后的臨床指標(biāo)。

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