于海，劉清華，肖培倫，王健欣，張明，蔣吉英，李進，于麗，于樹娜

（濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院a.人體解剖學教研室，b.組織胚胎學教研室，山東濰坊 261053）

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，病死率極高。據(jù)統(tǒng)計調(diào)查顯示，每年大約有13萬人死于肝癌［1］。雖然肝癌的臨床治療已經(jīng)取得了一定的進展，但發(fā)病率和病死率仍然居高不下，因此，肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等機制的研究一直備受關注。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，自噬活性的異常改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切相關［2-6］。本研究應用免疫組織化學SP法，檢測Beclin1、LC3和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）三種自噬基因在肝癌組織及正常肝組織中的表達，并結(jié)合各相關臨床病理指標，探討B(tài)eclin1、LC3和mTOR的表達水平在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相互之間的關系，從而為肝癌診療及判斷預后找到分子標志物，制定合理、有效的治療方案，最終提高患者的生存率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院和齊魯醫(yī)院2013年12月—2016年12月肝癌手術切除標本56例，標本均經(jīng)病理切片HE染色證實為肝癌，所有病例術前均未接受任何放化療、肝動脈栓塞及免疫治療。按Edmondson-steiner分級標準：I級8例，Ⅱ級14例，Ⅲ級24例，Ⅳ級10例；分別測量切除后的腫瘤直徑，其中≤5 cm者24例，＞5 cm者32例。收集肝癌標本中，男性40例，女性16例；年齡34～80歲，平均62歲；乙肝表面抗原（HBSAg）陽性者38例，陰性表達者18例；甲胎蛋白AFP≥400μg·L－1者30例，＜400μg·L－1者26例；有膽管癌栓者11例。同時取癌旁5 cm外正常肝組織標本40例作為對照組。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人Beclin1多克隆抗體、兔抗人LC3多克隆抗體均購自 Abcam公司，兔抗人mTOR多克隆抗體、通用型免疫組化檢測試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液、DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組織化學法 所有實驗標本均經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，以5μm厚連續(xù)切片。免疫組化技術采取SP法，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 采用雙盲法評估免疫組化染色切片，Beclin1、LC3和mTOR均以細胞膜和（或）細胞質(zhì)染成淡黃色、棕黃色或棕褐色為陽性表達。三者均采用二級計分法，陽性細胞計數(shù)：隨機任選5個高倍鏡視野（400×），然后根據(jù)每張切片的陽性細胞百分率計數(shù)，＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，≥50%為3分。著色強度分類：無著色計0分，淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，褐或棕褐色為3分。兩者計分相乘≥4分為免疫組化陽性（＋），＜4分計為免疫組化陰性（－）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩變量之間的相關性分析采用Spearman等級分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達 Beclin1蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為75%（42／56），在正常肝組織中的陽性表達率為25%（10／40），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

LC3蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為70%（39／56），在正常肝組織中的陽性表達率為30%（12／40），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

mTOR蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為50%（28／56），在正常肝組織中的陽性表達率為28%（11／40），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1～3。

表1 Beclin1、LC3和mTOR在肝癌及正常肝組織中的表達／例（%）

圖1 Beclin1蛋白在肝癌組織和正常肝組織中的表達（×400）

圖2 LC3在肝癌組織和正常肝組織中的表達（×400）

圖3 mTOR在肝癌組織和正常肝組織中的表達（×400）

2.2 肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR蛋白表達之間的相關性 Spearman等級分析結(jié)果顯示，在肝癌組織中Beclin1與LC3在肝癌中的表達呈正相關（r＝0.643，P＜0.01），與mTOR表達之間無明顯相關性（r＝－0.167，P＞0.05），LC3與mTOR表達呈負相關（r＝－0.386，P＜0.01）。

2.3 肝癌組織中Beclin1、LC3和mTOR蛋白表達與臨床病理特征之間的關系 Beclin1、LC3和mTOR的表達均與年齡、性別、腫瘤大小、HBSAg、AFP值等均無顯著相關性（P＞0.05），但與病理學分級和有無膽管癌栓有關（P＜0.05）。見表2。

表2 Beclin1、LC3和mTOR在肝癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關系／例（%）

3 討論

肝癌是臨床上最常見的惡性消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率己上升為我國惡性腫瘤的第2位，其嚴重威脅著人類的健康生活。近年來，臨床上對于肝癌的治療方法有很多，例如：手術切除、介入治療及放、化療等，但其治療效果均欠佳，總體5年生存率不超過5%。分析其原因為：由于其惡性程度高，早期癥狀不明顯，病情進展速度快，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時，已發(fā)生遠處侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。因此，通過對肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關機制的研究，顯得尤為迫切。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因調(diào)控機制失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關［2］。

至今為止，Beclin1作為唯一被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物參與自噬的特異性基因［8］，該基因位于人類染色體17q21上，大約有150 kb，編碼一個2 098 bp的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。有研究顯示［9］，在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中，Beclin1基因存在缺失性的突變。張創(chuàng)杰［10］研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1在胰腺癌中的表達低于正常胰腺組織。而本實驗結(jié)果顯示，Beclin1蛋白在肝癌組織（75%，42／56）中的陽性表達率高于正常肝組織（25%，10／40），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。分析其Beclin1在肝癌中高表達的原因，可能是由于肝癌生長迅速，腫瘤細胞需要自噬，以適應營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境。

LC3作為參與自噬發(fā)生的關鍵基因，其表達水平與自噬活性關系密切，是監(jiān)測自噬的特異性標志物［11］。LC3包括 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ，其中 LC3-Ⅱ可通過活化Atg12，結(jié)合Atg5，從而參與形成自噬體。有研究表明，LC3的異常表達與許多惡性腫瘤（例如：胃癌、大腸癌、宮頸癌等）的發(fā)生、發(fā)展及預后關系密切［12］。Huang等［13］報道了 LC3-Ⅱ在腦膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達降低，自噬活性下降。但是本研究結(jié)果顯示，LC3蛋白在肝癌組織（70%，39／56）中的陽性表達率高于正常肝組織（30%，12／40），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。上述結(jié)果說明，LC3的表達及作用在不同類型腫瘤中是各不相同的，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其分子機制還有待進一步研究。

哺乳動物mTOR作為PI3K／AKT信號傳導通路下游的效應靶蛋白，在其信號的傳導過程中扮演著重要的角色。當mTOR的活性被抑制時，可阻斷其下游S6K1信號傳導通路，使細胞由G1向S轉(zhuǎn)變所需的相關蛋白缺乏，細胞周期阻滯于G1期，進而達到影響細胞周期的進展，調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用。張利等［14］研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在結(jié)腸癌組織中的陽性表達率為78.5%，而在正常結(jié)腸組織中的陽性表達率為12%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示，mTOR蛋白在肝癌組織（50%，28／56）中的陽性表達率也高于正常肝組織（28%，11／40），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這說明mTOR的過度表達與激活可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切。

經(jīng)Spearman相關系數(shù)檢驗結(jié)果顯示，在肝癌組織中Beclin1與LC3在肝癌中表達呈正相關（r＝0.643，P＜0.01），與mTOR表達之間無明顯相關性（r＝－0.167，P＞0.05），LC3與 mTOR表達呈負相關（r＝－0.386，P＜0.01）。這說明，三者在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關系密切，Beclin1的高表達可以增強肝癌自噬活性，mTOR的高表達則會抑制肝癌自噬發(fā)生，兩者可能是通過不同PI3K（包括：Ⅰ型和Ⅲ型）信號傳導通路，分別發(fā)揮其自噬調(diào)控作用：（1）Ⅲ型PI3K復合物Vps15激酶通過調(diào)節(jié)PI3K的活性后，Beclin1即可將各種Apg蛋白整合到PI3K中，形成復合體來促進自噬的發(fā)生；（2）而mTOR接受其上游的Ⅰ型PI3K／AKT信號傳到通路調(diào)控后，可隨后磷酸化它的兩個下游分子，即翻譯抑制分子eIF-4E結(jié)合蛋白 1（4E-BP1）和核糖體蛋白 S6激酶 1（S6K1）［15］，進而來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖，抑制自噬活性。本實驗組56例肝癌組織中，Beclin1蛋白陽性表達者為42例，mTOR蛋白陽性表達者為28例，由此可見，Beclin1蛋白陽性表達者高于mTOR蛋白陽性表達者，所以我們推測Beclin1高表達所產(chǎn)生的促進自噬作用明顯強于mTOR過表達產(chǎn)生的抑制自噬作用，因此，自噬活性標志分子LC3蛋白表達水平均升高，即肝癌的自噬活性亦隨之增高。同時，本實驗還證實，在肝癌組織中，Beclin1、LC3和mTOR的表達均與年齡、性別、腫瘤大小、HBSAg、AFP值等均無顯著相關性（P＞0.05），但與病理學分級和有無膽管癌栓有關（P＜0.05）。

總之，Beclin1、LC3和mTOR蛋白在肝癌自噬活性調(diào)控中，發(fā)揮著至關重要的作用，因此聯(lián)合檢測三者的蛋白表達水平，可以更加客觀的評估肝癌患者的預后，從而為肝癌診療及判斷預后找到分子標志物，制定合理、有效的治療方案，最終提高患者的生存率。

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