江悅娟 張德勇（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 浙江杭州 310015）

引言

食品中抗生素殘留問題在我國較為嚴(yán)重，例如國家質(zhì)檢總局曾有調(diào)查顯示,其檢測(cè)的八百份乳品樣品中抗生素殘留超標(biāo)居不合格項(xiàng)目第一位。食品中殘留的抗生素可經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體并長期蓄積，這些抗生素很多對(duì)人體有毒副作用。更嚴(yán)重的是由于抗生素濫用會(huì)促進(jìn)耐藥菌產(chǎn)生，使人類將來或遭遇一些重大疾病“無藥可醫(yī)”的絕境[1]。當(dāng)前抗生素的檢測(cè)方法卻很不健全。例如農(nóng)業(yè)部《無公害農(nóng)產(chǎn)品管理辦法》明確了60余種獸藥殘留限值，但公布的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法卻僅有不到10種[2]。當(dāng)前抗生素殘留的檢測(cè)方法如液相、氣相色譜法、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)等，多具有精確、靈敏等優(yōu)勢(shì)，但普遍存在儀器昂貴、需要專業(yè)人員、操作繁瑣、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。因此開發(fā)一種操作簡單、廉價(jià)、高效的檢測(cè)技術(shù)具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究擬通過測(cè)定微孔板上培養(yǎng)的敏感菌在培養(yǎng)過程中受抑制情況來計(jì)算抗生素的含量[3-6]。其適用領(lǐng)域與抑菌圈法相似，但具有高通量的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

藤黃微球菌[CMCC(B)28001]購自中國微生物菌種保藏中心。土霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。培養(yǎng)基、常規(guī)試劑、酶標(biāo)儀等設(shè)備均由所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 微生物的微孔板培養(yǎng)條件的建立

對(duì)藤黃微球菌進(jìn)行吸光度全波長掃描，確定適用波長。并設(shè)計(jì)單因素法分別對(duì)微孔板培養(yǎng)法的菌液初始濃度（A450在0.1-0.7范圍）、培養(yǎng)時(shí)間（2h-5h范圍）、搖床速度（150-300rpm范圍）等條件進(jìn)行優(yōu)化，以對(duì)照孔與樣品孔的差值為優(yōu)化依據(jù)。

1.3 抗生素濃度與菌液受抑制程度之間的線性關(guān)系建立

將倍比稀釋的抗生素(20μL/孔)加入含菌液（80μL/孔）的微孔板中，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，測(cè)A450值。分析建立A450值增長受抑制程度與抗生素劑量之間的關(guān)系式，作為測(cè)定公式。

1.4 牛奶樣品前處理方法

取10 mL牛奶樣品,加10mL乙酸乙酯,超聲震蕩30 min,4000rpm離心10 min,乙酸乙酯層60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),殘留物用2 mL甲醇溶解，待測(cè)。

1.5 檢出限測(cè)定

設(shè)計(jì)陰性對(duì)照孔與空白孔，按照前面建立的方法培養(yǎng)3h后測(cè)定A450值，計(jì)算增加值ΔA450。其中空白孔視為樣品孔進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算，得出對(duì)應(yīng)的抗生素濃度值（μg/mL）。重復(fù)測(cè)定7次，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差值（SD）。檢出限（μg/mL）=SD×3。

1.6 準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定

人為制備含有已知含量抗生素的樣品，按照所建立的方法進(jìn)行抗生素的前處理和含量分析。通過計(jì)算回收率反映本方法的準(zhǔn)確度?；厥章?測(cè)定濃度/理論濃度。用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差（RSD）反映方法的精密度。RSD=標(biāo)準(zhǔn)誤差/算術(shù)平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物的微孔板培養(yǎng)條件的建立

藤黃微球菌在可見光范圍沒有特征吸收峰，其吸光度與波長成反比，在紫外光區(qū)雖有一個(gè)峰，但穩(wěn)定性欠佳。綜合考慮常規(guī)酶標(biāo)儀的條件，本研究選擇450nm作為測(cè)定波長。菌液起始濃度，確定A450值在0.33左右為宜。搖床轉(zhuǎn)速以250rpm為宜。測(cè)定時(shí)間的選擇，以3h最佳，時(shí)間延長雖然差值更明顯，但X、Y兩個(gè)因素之間的線性規(guī)律出現(xiàn)紊亂，符合線性規(guī)律的范圍變窄。兩種微孔板的比較顯示96孔板好于48孔板。

2.2 抗生素濃度與菌懸液吸光度值抑制效應(yīng)的線性方程建立

微孔板中的抗生素濃度與吸光度值之間是近似冪曲線。如果設(shè)定X=陰性對(duì)照孔ΔA450-樣品孔ΔA450；Y=土霉素的稀釋指數(shù)值；則X、Y之間存在線性關(guān)系，R2值分別為0.9837。經(jīng)轉(zhuǎn)換后，微孔板中抗生素濃度計(jì)算公式如下：土霉素濃度（μg/mL）=0.15625*2^[33.795(ΔA0-ΔA)-1.9486]；其中 ΔA0為陰性對(duì)照孔的A450增加值，ΔA為待測(cè)孔的A450增加值。

2.3 檢出限、準(zhǔn)確度與精密度

經(jīng)計(jì)算，本方法的檢出限分別為0.0591ng/mL（以微孔板中的土霉素濃度表示）。本方法平均回收率為86.33%，RSD為6.37%。

結(jié)語

為了探索一種簡便高效的檢測(cè)土霉素殘留的生物法，以藤黃微球菌為指示菌，在96孔板上優(yōu)化了其培養(yǎng)條件，新鮮菌液（A450約0.3）培養(yǎng)3h后，其A450值增長受抑制情況與抗生素的劑量之間存在相關(guān)性良好的回歸方程（R2=0.9837），故可根據(jù)生長受抑制程度計(jì)算抗生素含量。