許有忠，田 作春，李才

（海南省第三人民醫(yī)院 心胸外科，海南 三亞 572000）

非 小 細(xì) 胞 肺 癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是癌癥死亡的主要原因之一[1]。由于早期診斷率低，只有大約20%的病例能夠在早期進(jìn)行有效的手術(shù)切除[2]。此外，非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)率高，約50%的患者手術(shù)后會發(fā)生遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)。因此，尋找特異性和敏感性均較高的腫瘤標(biāo)志物，并與多種篩查方法相結(jié)合有望提高對非小細(xì)胞肺癌的早期診斷。微小RNA（microRNA）在腫瘤組織中性質(zhì)穩(wěn)定、功能廣泛[3]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-204（miR-204）在子宮內(nèi)膜樣腺癌[4]、鼻咽癌[5]等腫瘤組織中表達(dá)降低，并與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)；且上調(diào)腫瘤細(xì)胞中miR-204，可以抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制遷移、增加對化療藥物的敏感性。在膽管癌的研究中發(fā)現(xiàn)，將miR-204模擬物導(dǎo)入膽管癌細(xì)胞系后能夠負(fù)向調(diào)控Bcl-2的表達(dá)，且能夠促進(jìn)化療藥物氟尿嘧啶激發(fā)的細(xì)胞凋亡[6]。但miR-204在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚不十分明確。本研究通過對NSCLC患者病變組織中miR-204的表達(dá)進(jìn)行檢測，以便了解miR-204在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義，并對miR-204影響癌細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制進(jìn)行初步探究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇海南省第三人民醫(yī)院收治的NSCLC患者60例，其中,男性34例，女性26例；年齡42～77歲、平均（56.4±7.9）歲。分別取其肺癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，手術(shù)切除標(biāo)本立即放入液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r收集患者臨床病理特征資料。所有病例術(shù)前均尚未接受化療或放療。所有樣本均經(jīng)研究對象同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

人非小細(xì)胞肺癌A-549細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，F(xiàn)12K培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自美國Gibco公司，CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)公司，RNA提取試劑盒購自美國Omega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、SYBR實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒等均購自大連寶生物工程有限公司。miR-204模擬物、miR-204抑制物及miR-204和內(nèi)參U6的引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，兔抗人Bcl-2抗體購自美國Cell Signaling Tech nology公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、兔抗人b-actin購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司，BCA試劑盒購自廣州碧云天有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

非小細(xì)胞肺癌A-549細(xì)胞株培養(yǎng)在37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)液為F12K培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）。轉(zhuǎn)染分為4組：對照組、陰性對照組、miR-204模擬物組、miR-204抑制物組。按說明書將各組轉(zhuǎn)染物與脂質(zhì)體2000混合靜止后轉(zhuǎn)染A-549細(xì)胞。另取各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞以100μl/孔（約含1×104個細(xì)胞）接種于96孔板中，每組設(shè)6個平行孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48和72 h后，各孔加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀（CliniBiog酶標(biāo)儀）在450 nm 波長測定各孔吸光度（OD值），以O(shè)D值代表細(xì)胞相對增殖水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡情況檢測

4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，分別取1×105個細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500μl結(jié)合液重懸細(xì)胞。隨后加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻，室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀（BD FACSCzlibur）檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 肺癌組織和細(xì)胞中總RNA提取及qRT-PCR檢測

凍存肺癌組織及其對應(yīng)癌旁組織各取約100 mg×6份、4組轉(zhuǎn)染后的A-549細(xì)胞各收集約1×107個細(xì)胞，分別加入1 ml Trizol，用總RNA試劑盒提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)對提取的總RNA檢測純度及定量。將總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；取cDNA采用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法表示相對表達(dá)量。

1.6 Western blot檢測

各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集各組的細(xì)胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整每孔上樣量，將蛋白樣品在10% SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳（Bio-Rad SDS-PAGE電泳儀），電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h，TBS-T洗膜后分別加入Bcl-2（1︰1 000稀釋）、β-actin（1︰300稀釋）一抗，4℃冰箱孵育過夜。TBS-T洗膜后，加入二抗（1︰5 000稀釋）室溫孵育1 h，加發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像儀（JS-300凝膠圖像分析儀）拍照。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較為HSD-q檢驗(yàn)，多時點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，不同組織的mRNA表達(dá)水平的比較為配對t檢驗(yàn)，miR-204相對表達(dá)與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中miR-204的mRNA表達(dá)水平及其與各臨床特征參數(shù)的關(guān)系

與對應(yīng)癌旁組織比較，肺癌組織中miR-204 的mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表2）。人為界定肺癌組織中miR-204 的mRNA相對表達(dá)量＜2.41為低表達(dá)，≥2.41為高表達(dá)。再按基線指標(biāo)或臨床病理特征的不同水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-204低表達(dá)與分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(guān)（P＜0.05）（見表 3）。

2.2 miR-204對A-549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

miR-204對人A-549細(xì)胞增殖和凋亡影響資料的比較 ，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)間的細(xì)胞增殖相對量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=416.149，P=0.000）。②4組細(xì)胞增殖相對量的整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=136.071，P=0.000）。③4組的細(xì)胞增殖相對量的變化趨勢差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.666，P=0.000）。見表 4。

表2 肺癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中miR-204的mRNA表達(dá)水平 （n =6，±s）

表2 肺癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中miR-204的mRNA表達(dá)水平 （n =6，±s）

組別 mRNA（2-ΔΔCt） t值 P值肺癌組織 2.41±0.91 9.361 0.000癌旁組織 5.62±1.08

表3 miR-204相對表達(dá)與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表4 miR-204對人A-549細(xì)胞增殖和凋亡的影響比較 （n =6，±s）

表4 miR-204對人A-549細(xì)胞增殖和凋亡的影響比較 （n =6，±s）

細(xì)胞增殖凋亡率/%24 h 48 h 72 h對照組 2.31±0.03 0.92±0.02 1.05±0.11 1.32±0.12t 14.71±1.10陰性對照組 2.20±0.05 0.82±0.03 0.94±0.05 1.25±0.05 17.28±0.90抑制物組 1.01±0.03 0.87±0.03 1.38±0.11 1.52±0.04 12.08±0.70模擬物組 4.03±0.08 0.62±0.02 0.69±0.02 0.80±0.02 21.90±1.20組別 相對量

經(jīng)qRT-PCR檢測A-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-204效果。與陰性對 照組相比，miR-204模擬物組的A-549細(xì)胞增殖水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而miR-204抑制物組細(xì)胞增殖水平則略有增高。miR-204模擬物組細(xì)胞凋亡率較陰性對照組升高，而miR-204抑制物組細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果提示miR-204表達(dá)水平可能與A-549細(xì)胞增殖及凋亡密切相關(guān)。miR-204對A-549細(xì)胞增值和凋亡影響見圖1、2。

2.3 miR-204對A-549細(xì)胞Bcl-2表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討miR-204影響A-549細(xì)胞增殖及凋亡的機(jī)制，本研究檢測了轉(zhuǎn)染miR-204模擬物后A-549細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物的A-549細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白水平均降低，而轉(zhuǎn)染miR-204抑制物的細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白水平則增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示了miR-204可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)水平來影響癌細(xì)胞的增殖及凋亡。見表5、圖3。

圖1 miR-204對A-549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖2 miR-204對A-549細(xì)胞凋亡的影響

圖3 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平

表5 miR-204對A-549細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平的影響 （n =6，±s）

表5 miR-204對A-549細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平的影響 （n =6，±s）

組別 Bcl-2水平 F值 P值對照組 0.98±0.07陰性對照組 0.92±0.04抑制物組 1.40±0.08模擬物組 0.48±0.02 255.042 0.000

3 討論

盡管非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制在蛋白及基因水平得到深入認(rèn)識，手術(shù)、放化療等為主的綜合治療有了長足的發(fā)展，但非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和預(yù)后并沒有明顯進(jìn)展。miRNAs是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，在細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮重要作用。最近，研究證明NSCLC中miRNAs的表達(dá)與其預(yù)后有關(guān)[7-8]，研究發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)miRNA-21提示預(yù)后較好。在非小細(xì)胞肺癌組織中有多種miRNAs表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，可作為非小細(xì)胞肺癌的癌基因或抑癌基因，在非小細(xì)胞肺癌分化、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[9]。

近年來，研究表明miR-204可能成為一種新的致癌基因或抑癌基因[10-11]。在前列腺癌中，miR-204發(fā)揮癌基因的作用，miR-204的高表達(dá)能導(dǎo)致前列腺衍生上皮因子（prostate-derived epithelial factor，PDEF）的丟失從而促使前列腺癌發(fā)生[12]。而在頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株中過表達(dá)的miR-204，通過抑制腫瘤相關(guān)靶基因的表達(dá)，并在體外抑制腫瘤的黏附、遷移和侵襲，減少了實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移的程度，發(fā)揮抑癌基因的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-204相對表達(dá)量低于癌旁組織，并且在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物的A-549細(xì)胞增殖水平受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-204抑制物細(xì)胞增殖水平則略有增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 miR-204可能作為一種抑癌基因通過抑制癌細(xì)胞的增殖來參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展。

Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，作為一種原癌基因能廣泛抑制細(xì)胞凋亡，從而有利于腫瘤細(xì)胞的生長[14-16]。CHEN等[6]將miR-204模擬物導(dǎo)入膽管癌細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)外源性miR-204具有負(fù)向調(diào)控Bcl-2的作用，且有利于化療藥物氟尿嘧啶激發(fā)的細(xì)胞凋亡。在本研究細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物的細(xì)胞增殖水平受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-204抑制物細(xì)胞增殖水平則略有增高。流式檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)模擬物組細(xì)胞凋亡率較陰性對照組升高，而抑制物組細(xì)胞凋亡率降低。為進(jìn)一步探討miR-204影響肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的可能機(jī)制，本研究檢測了轉(zhuǎn)染miR-204肺癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)情況，結(jié)果表明，高表達(dá)miR-204后，肺癌細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，抑制miR-204后細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平則升高，提示miR-204影響肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的作用可能通過調(diào)控Bcl-2的表達(dá)而發(fā)揮效應(yīng)。

綜上所述，miR-204在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與發(fā)展過程中可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)靶基因Bcl-2影響細(xì)胞增殖及凋亡而實(shí)現(xiàn)的。

[1]SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A. Cancer statistics, 2015[J].CA Cancer J Clin, 2015, 65(1): 5-29.

[2]丁斐嘉, 邵群慧, 張鳴號, 等. 檢測GK19基因?qū)υ\斷非小細(xì)胞肺癌外周血微轉(zhuǎn)移的意義[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 36(9):962-965.

[3]PILECZKI V, COJOCNEANU-PETRIC R, MARALANI M, et al.MicroRNAs as regulators of apoptosis mechanisms in cancer[J].Clujul Med, 2016, 89: 50-55.

[4]劉婕, 萬曉春, 呂衛(wèi)東, 等. miRNA在防治非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 15(10): 1966-1970.

[5]MA L, DENG X, WU M, et al. Down-regulation of miRNA-204 by LMP-1 enhances CDC42 activity and facilitates invasion of EBV-associated nasopharyngeal carcinoma cells[J]. FEBS Lett, 2014,588(9): 1562-1570.

[6]CHEN L, YAN H X, YANG W, et al. The role of microRNA expression pattern in human intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. J Hepatol, 2009, 50(2): 358-369.

[7]YU S L, CHEN H Y, CHANG G C, et al. MicroRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer[J]. Cancer Cell, 2008,13(1): 48-57.

[8]LANDI M T, ZHAO Y, ROTUNNO M, et al. MicroRNA expression differentiates histology and predicts survival of lung cancer[J].Clin Cancer Res, 2010, 16(2): 430-441.

[9]SKRZYPSKI M, CZAPIEWSKI P, GORYCA K, et al. Prognostic value of microRNA expressio n in operable non-small cell lung cancer patients[J]. Br J Cancer, 2014, 110(4): 991-1000.

[10]SHI Y, HUANG J, ZHOU J, et al. MicroRNA-204 inhibits proliferation, migration, invasion and epithelial-mesenchymal transition in osteosarcoma cells via targeting Sirtuin 1[J]. Oncol Rep, 2015, 34(1): 399-406.

[11]YIN J J, LIANG B, ZHAN X R. microRNA-204 inhibits cell proliferation in T-cell acute lymphoblastic leukemia by downregulating SOX4[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(8): 9189-9195.

[12]TURNER D P, FINDLAY V J, MOUSSA O, et al. Mechanisms and functional consequences of PDEF protein expression loss during prostate cancer progression[J]. Prostate, 2011, 71(16):1723-1735.

[13]LEE Y, YANG X, HUANG Y, et al. Network modeling identifi es molecular functions targeted by miR-204 to suppress head and neck tumor metastasis[J]. PLoS Comput Biol, 2010, 6(4):e1000730.

[14]BRENNER D, MAK T W. Mitochondrial cell death eff ectors[J].Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(6): 871-877.

[15]GHIOTTO F, FAIS F, BRUNO S. BH3-only proteins: the deathpuppeteer’s wires[J]. Cytometry A, 2010, 77(1): 11-21.

[16]CZABOTAR P E, LESSENE G, STRASSER A, et al. Control of apop tosis by the BCL-2 protein family:implications for physiology and therapy[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(1):49-63.