楊小利，殷亞楠，胡文淼，張理斐，童麗，孫志平，程坤，王亞君

（1.河南省鄭州市第三人民醫(yī)院 兒科，河南 鄭州 450000；2.河南省鄭州市第二人民醫(yī) 院 神經(jīng)內科，河南 鄭州 450000）

腦缺血（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）是由于腦組織中供血不足引起的。在世界范圍內，每年有超過560萬人因為腦缺血而導致殘疾或者死亡，嚴重威脅著人類健康[1]。在臨床上，腦缺血是第三大危害人類健康的疾病。有研究表明，腦缺血后的4.5 h后，若對腦缺血區(qū)域進行再灌注會加重神經(jīng)細胞的損害程度，這被稱為腦缺血再灌注損傷[2]。由于腦缺血多是由于外界作用引起的，治療時往往超過了4.5 h[3]。腦缺血再灌注損傷是目前研究的熱點。

后膜骨架蛋白1（Homer 1）存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。Homer 1具有調控胚胎腦組織發(fā)育、調控大腦學習能力等生理作用。Homer 1可以分為Homer 1a、Homer 1b、Homer 1c。Homer 1a參與調控抑郁癥、癲癇等多種疾病的發(fā)生，是目前研究最多的Homer蛋白。有研究表明，Homer 1a在顱腦創(chuàng)傷中高表達[5]。目前尚未見Homer 1a與腦缺血再灌注損傷的相關研究。本研究復制Homer1a基因敲除小鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討Homer 1a在腦缺血再灌注損傷中的作用，以期為治療腦缺血再灌注提供新思路。

1 材料與方法

1.1.1 實驗動物40日齡Homer1a基因敲除小鼠10只和40日齡野生型小鼠20只購自于鄭州大學動物實驗中心，體重18～22g。

1.1.2 主要儀器及試劑 水浴鍋（上海雷韻試驗儀器制造有限公司），超凈工作臺（蘇州施威克環(huán)?？萍加邢薰荆琍CR儀[賽飛（中國）有限公司]，顯微鏡（上海上光新光學科技有限公司），石蠟切片機（德國LEICA公司），離心機（湖南邁達儀器有限公司），PVDF膜（美國Sigma公司），PBS（ 北京鼎國生物試劑有限公司），蛋白酶K（ 美國Sigma公司），IL-6單克隆抗體、IL-1β單克隆抗體、TNF-α單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物標記的二抗

1.1 材料

（美國CTS公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠模型復制 實驗分為3組，Homer1a基因敲除小鼠10只為實驗組，野生型小鼠20只隨機分為兩組，分別為腦缺血組和對照組。所有的實驗動物在構建前均禁食1 d，飲水不限制。分別用濃度為3%的異氟烷麻醉實驗組和腦缺血組的小鼠，連接麻醉 器，用濃度為1%的異氟烷與一氧化二氮N2O和氧氣O2混合維持麻醉。將小鼠四肢固定在手術操作板上，使小鼠仰臥，用碘消毒后，沿中線剪開皮膚，使頸部血管暴露。將血管周圍組織剝離后，順著頸總動脈找到分叉處。小心分離頸外動脈和頸內動脈。用血管夾結扎靠近心段的頸總動脈處和靠近頸總動脈分叉處的頸外動脈。頸內動脈打活結，分別牽拉頸內動脈和頸外動脈，使頸內動脈暫時性閉塞。用眼科剪在遠離心端的頸總動脈處剪一個小口，插入拴線后，將拴線固定在頸內動脈活結處的備線上?？p合后，將小鼠放在37℃的環(huán)境下2 h。觀察小鼠蘇醒后麻醉，把拴線抽出來，用Willis環(huán)對小鼠實現(xiàn)動脈缺血后再灌注。對照組的小鼠不插入拴線，操作步驟同實驗組和腦缺血組。

1.2.2 行為學評分 腦缺血再灌注后的各組小鼠進行行為學評分。評分標準為0～5分制。小鼠可以直線行走記為0分；小鼠對側的前爪不能自由活動記為1分；身體無意識的向對側轉圈記為2分；小鼠的身體不自主的向一邊傾斜記為3分；小鼠昏迷記為4分；小鼠死亡記為5分。行為學評分在1～3分認為腦缺血再灌注模型復制成功。

1.2.3 TTC染色計算小鼠腦梗死體積 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，脫臼處死。放置于冰上，斷頭取出腦組織，洗滌后放在腦槽中，腦組織切片，每片厚度控制在1 mm左右，放在濃度為2%的TTC生理鹽水中，放置于室溫下?lián)u床緩慢震蕩，避光反應30 min。取出腦切片，觀察腦梗死區(qū)域，分析計算腦梗死體積。

1.2.4 Tunel法檢測細胞凋亡 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，常規(guī)方法制作腦組織石蠟切片。分別將石蠟切片放置于二甲苯中浸泡15 min。在95%、90%和80%濃度 的酒精中浸泡3 min。用PBS洗滌3次，5 min/次，放置于濃度為30%的過氧化氫H2O2溶液中浸潤20 min。用PBS洗滌3次，5 min/次，加入蛋白酶K放置于37℃孵育40 min，加入PBS洗滌3次，5 min/次。取適量Tunel染液于切片上，放置于37℃孵育60 min。用PBS洗滌3次，5 min/次。滴加丙三醇C3H8O3封片，放置在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。隨機選取5個視野，計算細胞凋亡情況。

1.2.5 GFAP法檢測星形膠質細胞 小鼠腦組織切片脫蠟止水后，放置于檸檬酸高壓鍋內，沸水煮沸60 s，放置于修復液40 s，小心滴加抗體后，用PBS洗滌3次×5 min，加入過氧化物后放在避光處室溫孵育20 min，PBS洗滌后，滴加驢血清放置于室溫下封閉50 min。加入以1︰100稀釋的一抗在4℃孵育過夜，加入熒光素酶標記的二抗，在室溫條件下孵育60 min，加入PBS洗滌后，加入HOECHST溶液，孵育10 min，丙三醇封片。顯微鏡下觀察星形膠質細胞，隨機選取5個視野計數(shù)星形膠質細胞數(shù)量。

1.2.6 Western blot檢測IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平 各組中小鼠腦缺血再灌注后24 h，取出小鼠腦組織，用剪刀剪碎后放在勻漿器中，取適量的裂解液加入到勻漿器后，在冰上研磨。將研磨的組織液轉移到EP管中，4℃，10 000 r/min離心10 min。轉移蛋白上清液至新的EP管中，根據(jù)BCA蛋白濃度檢測試劑盒操作步驟檢測提取的蛋白濃度。將蛋白與loading buffer充分混合后，放在100℃中煮沸5 min使蛋白充分變性。取50μl變性蛋白加入到上樣孔中，80 V電壓電泳30 min后，調整電壓為120 V至電泳結束。取出蛋白凝膠在自來水下小心沖洗后，按照常規(guī)方法4℃轉膜。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后，分別依次與一抗二抗孵育，PBST洗滌后，加入顯色液，在暗室中曝光，拍照，分析蛋白表達含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料3組數(shù)據(jù)的比較采用方差分析，在方差分析有意義的基礎上，再采用LSD-t檢驗兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 行為學評分結果

實驗組、腦缺血組、對照組中小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，根據(jù)行為學評分標準進行評分，評分越高說明小鼠腦缺血再灌注損傷越嚴重。結果顯示，正常組評分＜1，腦缺血組和實驗組小鼠行為學評分在介于1～3之間，說明成功復制了腦缺血再灌注小鼠模型。實驗組小鼠行為學評分高于腦缺血組，說明Homer1a基因敲除小鼠腦缺血再灌注損傷較腦缺血組更為嚴重。見圖1。

2.2 各組腦梗死情況

各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，取出腦組織，切片后，TTC染色觀察小鼠腦梗死情況。結果顯示：實驗組與腦缺血組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組小鼠腦梗死體積較腦缺血組增多；實驗組和腦缺血組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組與腦缺血組小鼠腦梗死體積較正常組增多。見圖2。

2.3 各組細胞凋亡情況

圖1 腦缺血再灌注小鼠行為學評分結果

圖2 腦缺血再灌注小鼠中腦梗死體積百分比

各組小鼠腦缺血再灌注損傷后24 h，取出腦組織，切片后，Tunel法檢測細胞凋亡結果。結果顯示：實驗組與腦缺血組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組小鼠腦組織細胞凋亡情況高于腦缺血組；實驗組和腦缺血組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組與腦缺血組小鼠腦組織中細胞凋亡情況多于正常組。見圖3。

圖3 腦缺血再灌注小鼠腦組織中細胞凋亡情況

2.4 星形膠質細胞檢測結果

腦缺血再灌注損傷會引發(fā)星型膠質細胞的增生和活化，進而產(chǎn)生GFAP蛋白，本研究中腦組織切片與GFAP蛋白一抗和二抗孵育后，在顯微鏡下觀察GFAP陽性細胞數(shù)即為星形膠質細胞數(shù)量。結果顯示：實驗組和腦缺血組分別與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組和腦缺血組小鼠腦組織中星形膠質細胞數(shù)都高于正常組，而實驗組小鼠腦組織中星型膠質細胞數(shù)量低于腦缺血組，這可能與Homer 1a蛋白和星形膠質細胞膜受體相互作用有關。見圖4。

2.5 各組IL-1β、TNF-α、IL-6表達

各組中小鼠腦缺血再灌注后24 h，取出小鼠腦組織，經(jīng)蛋白提取，Western blot檢測細胞中IL-1β、TNF-α、IL-6表達。結果顯示，實驗組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平與腦缺血組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組高于腦缺血組；實驗組和腦缺血組小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6表達水平與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組與腦缺血組均高于正常組。見圖5。

圖4 各組星型膠質細胞數(shù)結果

圖5 腦缺血再灌注小鼠中IL-1β、TNF-α、IL-6的表達

3 討論

腦缺血是一種臨床上常見的疾病。高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化、應激、外力刺激等都可以引起腦缺血的發(fā)生[6]。腦缺血死亡率極高，是一種嚴重危害人類生命健康的疾病。Homer是一種廣泛存在于哺乳動物腦組織中的支架蛋白。Homer蛋白參與調控多種信號通路，在突觸的發(fā)育過程中具有重要作用[7-8]。Homer蛋白在精神分裂、智力發(fā)育、創(chuàng)傷性腦損傷、阿爾茨海默病、腦膠質瘤、癲癇等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[9]。Homer 1a屬于Homer蛋白家族中的一員。已經(jīng)有研究表明，神經(jīng)元細胞受到機械損傷時，Homer 1a表達上調，與代謝性谷氨酸受體作用后，對神經(jīng)元細胞具有一定的保護作用[10-11]。

當發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，細胞凋亡和細胞壞死是細胞死亡的2種方式。細胞凋亡主要發(fā)生在損傷程度較輕的區(qū)域，這些區(qū)域細胞缺血的時間較短[12-13]。而細胞壞死則發(fā)生在損傷程度較為嚴重的區(qū)域，這些區(qū)域細胞缺血時間較長，屬于缺血的核心區(qū)域[14]。本研究中，用TTC和Tunel法分別檢測了腦缺血再灌注小鼠腦組織中腦梗死情況和細胞凋亡情況。結果顯示，實驗組小鼠腦梗死體積和細胞凋亡數(shù)目較腦缺血組明顯增多，這提示，Homer1a基因敲除小鼠細胞腦缺血再灌注損傷程度較為嚴重。Western blot檢測腦缺血再灌注小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達均高于正常組，而基因敲除小鼠中炎癥因子的表達量高于單純腦缺血再灌注組，進一步說明了缺失Homer1a基因，會加重腦缺血再灌注損傷。

神經(jīng)膠質細胞和神經(jīng)元細胞是腦組織中數(shù)量最多的細胞，而神經(jīng)膠質細胞具有給神經(jīng)元細胞提供營養(yǎng)的作用[15]。星形膠質細胞的數(shù)量占神經(jīng)膠質細胞的50%，是腦缺血再灌注損傷中最早受到影響的細胞。研究表明，星形膠質細胞產(chǎn)生的具有抗氧化作用的谷胱甘肽可以調控谷氨酸的攝取和釋放[16]，從而促進紅細胞生成素的合成。另外星形膠質細胞還可以作用于水通道蛋白，對鈣離子興奮性、神經(jīng)信號的整合、神經(jīng)元的橋接等發(fā)揮抑制作用[17-18]。興奮性氨基酸谷氨酸的異常增多，會對神經(jīng)元產(chǎn)生興奮性毒性，損害神經(jīng)元細胞。另一方面，星形膠質細胞可以通過調節(jié)鈉離子通道調控谷氨酸轉運體，作用于谷氨酸的重新攝取，減輕了谷氨酸引起的興奮性毒性[19-20]。本研究中，腦缺血再灌注小鼠中星形膠質細胞的數(shù)量多于正常組，而基因敲除后的腦缺血再灌注小鼠腦組織中星形膠質細胞增生和活化數(shù)目較單純腦缺血再灌注小鼠明顯降低，這提示，Homer1a基因敲除后對星形膠質細胞的活化和增生具有一定的抑制作用。這可能與Homer 1a蛋白調控谷氨酸受體有關。谷氨酸受體在腦缺血再灌注的星形膠質細胞中高表達，而谷氨酸受體又與星形膠質細胞的凋亡有關。Homer 1a在這一系列過程中具有連接作用，導致Homer 1a蛋白和谷氨酸受體之間的平衡失調，抑制了星形膠質細胞的凋亡。

綜上所述，本研究成功復制了腦缺血再灌注小鼠模型，Homer1a基因敲除加重腦缺血再灌注損傷。Homer 1a對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。這為進一步研究腦缺血再灌注損傷奠定了基礎。

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