劉騰飛+張漢虞+尹辛格+儲嬌艷+邱樂泉

摘要：本文通過鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）誘導(dǎo)Arthrobacter sp. ZJUTW后，制備粗酶液，考察其對DBP的酶促降解特性，結(jié)果表明：酶促最適反應(yīng)溫度為30℃，最適pH為8.0，在10-30℃和pH7.0-9.0均有較好的穩(wěn)定性， K+、Mn2+、Mg2+則具有激活的作用，Ca2+對酶活性無明顯影響，Zn2+、Ba2+和Co2+對酶活性有輕微的抑制，F(xiàn)e3+、Cu2+對酶活性有較強(qiáng)的抑制作用；在以甲醇溶解的DBP為底物時，根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，推測其轉(zhuǎn)酯化降解途徑為DBP→鄰苯二甲酸丁基甲酯（BMP）→鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）→鄰苯二甲酸（PA）。

關(guān)鍵詞：Arthrobacter sp.；鄰苯二甲酸二丁酯；酶促降解；轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

中圖分類號：X13 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2018）01-0111-02

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.01.064

Biodegradation of dibutyl phthalate by enzyme from Arthrobacter sp. ZJUTW and its transesterification pathway

Liu Tengfei， Zhang Hanyu， Yin Xingge，Chu Jiaoyan， Qiu Lequan

（College of Biotechnology and Bioengineering， Hangzhou Zhejiang 310032， China）

Abstract： After the Arthrobacter sp. ZJUTW was induced by dibutyl phthalate （DBP）， the crude enzyme solution was prepared and the enzymatic degradation of DBP was investigated. The results showed that the optimum reaction temperature was 30℃， The optimal pH value was 8.0， which was stable at 10-30 ℃ and pH 7.0-9.0. K +， Mn2+ and Mg2+ had an active effect. Ca2+ had no significant effect on the enzyme activity. Zn2+， Ba2+ and Co2+ Activity was slightly inhibited， Fe3+， Cu2+ strong inhibitory effect on enzyme activity； dissolved in methanol DBP as a substrate， according to GC-MS analysis， speculated that the transesterification degradation pathway DBP → butyl-methyl phthalate（BMP）→ Dimethyl phthalate （DMP） → Phthalic acid （PA）.

Keywords： Arthrobacter sp .； Dibutyl phthalate； Enzymatic degradation； Transesterification

鄰苯二甲酸酯（Phthate acid esters，PAEs）是世界上廣泛使用的人工合成的難降解有機(jī)化合物，主要用于塑料增塑劑、涂料、油漆等的化工生產(chǎn)。已有證據(jù)表明，PAEs是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其最明顯的危害是使生殖機(jī)能下降，對動物及人類生殖系統(tǒng)有一定損害，可引起睪丸萎縮、精子減少、生殖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，且對胚胎發(fā)育有一定毒性 [1]。微生物降解被認(rèn)為是自然環(huán)境中完全礦化的主要過程[2]，過去的研究中已分離到多種微生物表現(xiàn)出了降解鄰苯二甲酸酯的能力，其中針對酯鍵的催化反應(yīng)是一個共同的起始步驟，對起始步驟主要涉及的有酯水解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)以及β氧化反應(yīng)等方式[3-6]。本文研究了從杭州河道污泥中分離的一株DBP降解菌Arthrobacter sp. ZJUTW的酶促降解特性，并分析了其轉(zhuǎn)酯化降解途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種

Arthrobacter sp. ZJUTW為本實驗室篩選所得，保藏編號為CCTCC M2012246。

1.2 試劑

DBP（98%），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（HPLC級）購自天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基（g/L）

K2HPO4·?H2O 1.0，NaCl 1.0，（NH4）2SO4 0.5，MgSO4·?H2O 0.4，CaCl2 0.0755，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.0143，pH 7.0，115 ℃ 滅菌 30 min，加入DBP（溶于甲醇）使其終濃度為250mg/L。

1.4 方法

1.4.1 DBP降解酶的誘導(dǎo)與定位

將Arthrobacter sp. ZJUTW菌接種到培養(yǎng)基中，30℃，180rpm搖床培養(yǎng)48h，5000×g離心10min，收集菌體沉淀，0.02mmol/L pH 7.2磷酸緩沖液（PBS）洗滌2次后，放入DBP培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24h，于4℃，5000×g下離心10min得到具有DBP降解能力的菌體，加入適量的PBS制成菌懸液，將菌懸液置于冰浴中進(jìn)行超聲破碎后于4℃，12000×g下離心30 min，分別收集上清液與細(xì)胞碎片沉淀，HPLC檢測DBP降解率。

1.4.2 DBP的酶促降解特性分析

酶促反應(yīng)體系為：含DBP 125mg/mL（甲醇溶解）的0.02mmol/L pH 7.2 PBS中加入適量酶液，30℃反應(yīng)10min；通過改變溫度、pH、金屬離子等條件對Arthrobacter sp ZJUTW粗酶液的酶學(xué)特性進(jìn)行分析，HPLC檢測DBP降解情況，計算相對酶活力。

1.4.3 酶活力的測定及HPLC檢測DBP含量

在4mL 0.02mmol/L pH 7.2的PBS（含DBP 125mg/mL）中加入適量酶液，于30℃反應(yīng)10min后，沸水浴3min，冷卻后加入5 mL的二氯甲烷萃取，震蕩混勻后取有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，用1mL色譜級甲醇溶解，HPLC檢測DBP含量。DBP檢測方法為：采用Agilent 1100型HPLC色譜儀，色譜柱為Diamonsil C18（2）5μm 250×4.6mm，流動相為甲醇︰水= 90︰10，流速為1 mL/min，檢測波長為235 nm， 進(jìn)樣量為10 ?L。一個酶活力單位（U）設(shè)定為在30℃下，1min內(nèi)能催化1.0μmol的DBP所需的酶量。蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法 [7]。

1.4.4 GC-MS測定DBP降解中間產(chǎn)物

色譜條件：色譜柱為HP-5MS（30m×250 m×0.25 m）；載氣為高純度He，載氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；柱溫條件：初始溫度60℃，保持1 min，以60 /min升溫至220 ℃，保持2 min，以5 /min升溫至250 ℃，保持2 min，再以5 /min升溫至280 ℃，保持3 min；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電離能量70eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃ ；全掃描（SCAN）質(zhì)量范圍：40 m/z～400 m/z；選擇離子掃描（SIM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Arthrobacter sp. ZJUTW的DBP降解酶的誘導(dǎo)與定位

通過DBP誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后的Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液的降解能力的比較（表1），發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前無降解能力，誘導(dǎo)后降解率為95%，表明該菌株對DBP的降解酶屬于誘導(dǎo)酶，而非組成型表達(dá)。對破碎細(xì)胞不同組分的DBP降解率檢測表明（表1），細(xì)胞破碎后的上清降解率達(dá)84%，而發(fā)酵液上清無降解能力，表明該菌株對DBP的降解酶屬于胞內(nèi)酶。

2.2 pH對粗酶液活性及其穩(wěn)定性的影響

在不同pH值的緩沖液體系中測定粗酶液活性及穩(wěn)定性的影響如圖1A所示，當(dāng)pH為8.0 左右時酶活最高，為最適pH；在不同pH值的緩沖液體系中放置30 min后測定其相對酶活力，結(jié)果表明，在pH7.0-9.0的范圍內(nèi)，DBP降解酶比較穩(wěn)定。

2.3 溫度對粗酶液活性及其穩(wěn)定性的影響

溫度對粗酶液活性及其穩(wěn)定性的影響如圖1B所示，25-35 ℃時相對酶活力較高，最適溫度為30 ℃；在10-30 ℃時，酶活力穩(wěn)定性良好；當(dāng)溫度升高到40 ℃及以上時，酶活力穩(wěn)定性較差，甚至失活。

2.4 金屬離子對Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液降解DBP的影響

終濃度為10mmol/L的不同金屬離子對粗酶液活性的影響表2所示，K+、Mn2+、Mg2+對酶活性具有激活作用，Ca2+對酶活性無明顯影響，Zn2+、Ba2+和Co2+對酶活性具有輕微的抑制，F(xiàn)e3+、Cu2+對酶活具有較強(qiáng)的抑制作用。

2.5 酯轉(zhuǎn)化降解途徑

Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液對以甲醇溶解的DBP為底物進(jìn)行降解后，GC-MS檢測結(jié)果顯示，降解產(chǎn)物中出現(xiàn)BMP、DMP、PA，推測該降解過程中先通過DBP酯酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，將甲醇的甲基轉(zhuǎn)移置換出一個丁基，形成不對稱酯BMP，然后再次轉(zhuǎn)移甲基置換出另一個丁基，形成DMP，其后再通過酯水解反應(yīng)，形成PA，因此其酯轉(zhuǎn)化降解的初始途徑為：DBP→BMP→DMP→PA。

3 結(jié)論

通過對Arthrobacter sp. ZJUTW的DBP誘導(dǎo)和細(xì)胞破碎研究，表明該菌株的DBP降解酶為胞內(nèi)的誘導(dǎo)酶，其粗酶液的最適pH和最適溫度分別為8.0和30 ℃，在pH7.0-9.0和10-30 ℃時，降解酶活力較為穩(wěn)定；K+、Mn2+、Mg2+對酶活性具有激活作用，Ca2+對酶活性無明顯影響，Zn2+、Ba2+和Co2+對酶活性具有輕微的抑制，F(xiàn)e3+、Cu2+對酶活具有較強(qiáng)的抑制作用。GC-MS分析降解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，該菌株對DBP的初始降解途徑為DBP→BMP→DMP→ PA。

參考文獻(xiàn)

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[6] Danielle V， Jean B. Dimethyl-phthalate hydrolysis by specific microbial esterase. Chemosphere， 2003，51：663-668.

[7] Bradford M M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem， 1976，72： 248–254.

收稿日期：2017-12-15

基金項目：浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY15C010002）

作者簡介：劉騰飛（1993-），男，在讀研究生，研究方向為環(huán)境微生物。