徐 立 宋文婷 任建勛 王光蕊 朱 盛 姚明江 侯金才 劉建勛

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100091)

缺血缺氧性腦病(Hypoxic-ischemic Encephalopathy,HIE)是指各種圍產(chǎn)期因素引起部分或完全缺氧和腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒及新生兒的中樞神經(jīng)損傷[1]。表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙及姿勢(shì)異常,常伴發(fā)智力低下、語(yǔ)言障礙等。該病發(fā)病率高,在住院新生兒中僅次于新生兒黃疸和新生兒肺炎,居于第3位,其導(dǎo)致的嬰幼兒殘障給家庭帶來(lái)痛苦,給社會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HIE相關(guān)動(dòng)物模型的研究鮮見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。本研究探索性建立小鼠缺氧缺血恢復(fù)期模型,觀察該模型小鼠在抓力、學(xué)習(xí)記憶能力、腦組織病理形態(tài)以及相關(guān)蛋白的表達(dá)等方面的變化,探討與小兒腦癱相關(guān)的動(dòng)物模型以及藥物治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 C 57 BL/6小鼠,雄性,18～22 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(京)2009-0007,合格證號(hào):0234931。

1.1.2 藥物 溶栓膠囊,0.25 g/粒,山西中遠(yuǎn)威藥業(yè)有限公司生產(chǎn),實(shí)驗(yàn)用其不含賦形劑的中間產(chǎn)品,批號(hào)20110503;異氟烷(吸入麻醉劑),山東科源制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):1012018。

1.1.3 試劑與儀器 二元?dú)?8%氧氣和92%氮?dú)?北京千禧京城氣體銷售中心提供。TB-718生物組織自動(dòng)包埋機(jī),TP10202徠卡全自動(dòng)組織脫水機(jī),Leica組織切片機(jī),Nikon顯微鏡。小鼠抓力測(cè)定儀(YLS-113A),濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 腦缺氧缺血恢復(fù)期模型的建立，根據(jù)文獻(xiàn)[2-3]給C 57 BL/6小鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,頸部正中切口,分開(kāi)肌肉層,暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈,穿絲線結(jié)扎,隨即縫合傷口,放入200 mm×150 mm×150 mm的容器中,通入8%氧氣和92%氮?dú)?5 min后放回鼠盒中飼養(yǎng)。假手術(shù)組(10只)只切開(kāi)皮膚后縫合,不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及置缺氧環(huán)境。第2天觀察動(dòng)物行為學(xué),輕提鼠尾,以左肩內(nèi)收,身體旋轉(zhuǎn)為模型成功,否則棄去不用。將模型成功小鼠隨機(jī)分組(每組10只),模型組,溶栓膠囊400、200、100 mg/kg劑量組。

1.2.2 給藥方法 手術(shù)后24 h開(kāi)設(shè)灌胃給藥,體積為20 mL/kg,1次/d,連續(xù)給藥4周。假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 小鼠抓力測(cè)定 給藥4周后,采用抓力測(cè)定儀測(cè)定動(dòng)物的抓力。將動(dòng)物輕輕放在抓力板上,抓住鼠尾輕輕向后牽拉,待小鼠抓牢抓力板后,均勻用力向后拉,致使動(dòng)物松爪,儀器自動(dòng)記錄小鼠的最大抓力,重復(fù)測(cè)定3次,取均值。

1.2.3.2 MORRIS水迷宮測(cè)定 水池中放入牛奶,充分混勻至水呈乳色,使小鼠無(wú)法通過(guò)視覺(jué)辨認(rèn)平臺(tái)位置。正式試驗(yàn)前,小鼠訓(xùn)練1次/d,連續(xù)訓(xùn)練4 d。訓(xùn)練及正式試驗(yàn)期間,迷宮外參照物保持不變。訓(xùn)練日將小鼠面向池壁放入水中,訓(xùn)練其找到平臺(tái)。訓(xùn)練時(shí)間180 s。180 s內(nèi)未找到平臺(tái)者,將其引至平臺(tái),使之站立臺(tái)上30 s,產(chǎn)生記憶。第5天正式試驗(yàn),自動(dòng)錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠180 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(游泳持續(xù)時(shí)間)、游泳路徑長(zhǎng)度,同時(shí)確定搜索策略等指標(biāo)。

1.2.3.3 腦組織鏡下觀察 給藥4周后,麻醉動(dòng)物并打開(kāi)胸腔,經(jīng)升主動(dòng)脈段快速灌注4 ℃生理鹽水,直至剪開(kāi)的肝臟流出液清亮為止;用4%的多聚甲醛灌注固定,斷頭取腦,將大腦組織置于4%的甲醛溶液中固定,24 h后進(jìn)行脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋,制成5 μm厚切片。將石蠟切片HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察皮層神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.2.3.4 腦組織免疫組化方法 采用PV-6000二步法免疫組化法。每組取6只動(dòng)物切片,隨機(jī)取3個(gè)視野,取其平均值。將采集的圖像應(yīng)用Image-pro Plus 5.1分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,所得數(shù)據(jù)作免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性信號(hào)累積光密度(IOD),以IOD值作為組織表達(dá)的定量標(biāo)準(zhǔn)。累積光密度(IOD)=平均光密度(AHD)×陽(yáng)性面積(A)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)HIE小鼠動(dòng)物抓力的影響 給藥4周后,模型組小鼠的抓力下降,與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,溶栓膠囊3個(gè)劑量組小鼠抓力均顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)HIE小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 造模4周后,模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低,與假手術(shù)組比較,尋找水迷宮平臺(tái)時(shí)間以及路徑長(zhǎng)度均明顯延長(zhǎng)(P<0.05～0.01)。給藥4周后,與模型組比較,溶栓膠囊200、400 mg生藥/kg組小鼠尋找水迷宮平臺(tái)的時(shí)間以及路徑長(zhǎng)度均明顯縮短(P<0.05),溶栓膠囊100 mg生藥/kg組小鼠尋找平臺(tái)時(shí)間及路徑長(zhǎng)度均無(wú)明顯改變。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)HIE小鼠抓力和學(xué)習(xí)記憶能力的影響

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.3 腦組織病理形態(tài)變化 腦組織HE染色可見(jiàn)假手術(shù)組皮層為正常神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu);模型組動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂,大量變性、壞死及凋亡細(xì)胞,另見(jiàn)大片軟化灶;在溶栓膠囊大劑量組(400 mg/kg)中,神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊,細(xì)胞變性程度減輕,見(jiàn)少量壞死區(qū)域;但仍有小膠質(zhì)細(xì)胞增生,血管擴(kuò)張充血,炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 HIE C 57 BL/6小鼠神經(jīng)元病理形態(tài) (HE染色,×400)

注：A假手術(shù)組;B模型組;C溶栓膠囊400 mg生藥/kg組

2.4 對(duì)HIE小鼠腦組織NSE、MAP-2以及Caspase-3表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果表明,模型組小鼠腦組織NSE和MAP-2呈低表達(dá),與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),Caspase-3呈高表達(dá),與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);溶栓膠囊3個(gè)劑量組小鼠腦組織NSE和MAP-2表達(dá)均高于模型組(P<0.01),Caspase-3表達(dá)均低于模型組(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 對(duì)HIE小鼠腦組織NSE、MAP-2及Caspase-3 表達(dá)的影響

注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

腦組織的能量來(lái)源幾乎全部是有氧糖代謝,而腦內(nèi)的糖原又很少,腦代謝所需要的葡萄糖和氧全靠腦部充分的血液循環(huán)供應(yīng)。因此在缺氧、腦血流減少或暫停條件下必然導(dǎo)致腦組織的損傷,從而長(zhǎng)期影響肢體功能和智力水平。研究認(rèn)為腦血流量不能滿足腦組織的氧需求是新生兒腦損傷的一個(gè)主要病理因素[3]。有研究顯示,C 57 BL/6小鼠對(duì)腦缺血性損傷具有一定的敏感性,特別是在CA1區(qū)域[4]。

圖2 溶栓膠囊對(duì)HIE模型小鼠神經(jīng)元NSE、MAP-2 及Caspase-3表達(dá)的影響(HE染色,×400)

注：A假手術(shù)組;B模型組;C溶栓膠囊400 mg生藥/kg組

HIE臨床上視缺血缺氧持續(xù)時(shí)間和程度決定小兒意識(shí)、肌張力、反射、驚厥、病程和預(yù)后的程度,中度和重度缺血缺氧患兒均可表現(xiàn)為肌張力減弱或松軟,預(yù)后較差[5],且這個(gè)過(guò)程是不可逆的,可能導(dǎo)致患兒永久性的智力低下、腦性癱瘓[6]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,是特異性定位在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì),占腦內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的1.5%。文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)神經(jīng)元壞死時(shí),該酶外漏釋放于腦脊液;同時(shí)由于血腦屏障的開(kāi)放,因此血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶可升高[7-8]。目前血清或腦脊液中NSE不僅是判斷HIE的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)之一,而且可用于判斷HIE的輕中重程度以及預(yù)后[9-10]。微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)主要在神經(jīng)元胞體和樹(shù)突表達(dá),是神經(jīng)元樹(shù)突靜態(tài)結(jié)構(gòu)蛋白與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白、神經(jīng)絲和線粒體共同維持神經(jīng)結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)發(fā)育、分化和可塑性方面起作用,對(duì)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、合成活動(dòng)和神經(jīng)毒性起關(guān)鍵作用[11]。因此MAP-2被認(rèn)為是神經(jīng)生長(zhǎng)和修復(fù)相關(guān)蛋白,是研究神經(jīng)再塑的分子標(biāo)志物。它在腦缺血損傷中呈現(xiàn)出敏銳的敏感性,缺血3 min即可表現(xiàn)為表達(dá)缺失。Caspase-3屬于白介素1β轉(zhuǎn)換酶家族,是涉及細(xì)胞凋亡的蛋白酶。它參與了腦缺血后神經(jīng)元損傷的病理過(guò)程,在腦缺血中起重要作用[12]。Caspase-3介導(dǎo)蛋白酶水解級(jí)聯(lián)過(guò)程。當(dāng)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元被剝奪血清和處于去極化水平的K+存在的情況下,神經(jīng)元出現(xiàn)活性C-JUN暫時(shí)性增加、線粒體膜電位喪失,Caspase-3蛋白酶激活和出現(xiàn)核凝集、核碎片,最后神經(jīng)元死亡[13]。

本研究從腦缺血缺氧的病理角度出發(fā),采用頸總動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)合通入氧氮二元?dú)獾姆椒ń 57 BL/6小鼠HIE模型,并飼養(yǎng)4周,檢測(cè)HIE小鼠恢復(fù)期的相關(guān)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),C 57 BL/6小鼠在此復(fù)合方法的誘導(dǎo)下出現(xiàn)病理性損傷,表現(xiàn)為小鼠肌力下降和學(xué)習(xí)記憶能力障礙,病理形態(tài)顯示神經(jīng)元損傷,NSE和MAP-2低表達(dá),Caspase-3高表達(dá),證實(shí)該模型的檢查指標(biāo)與臨床基本符合,制備模型的方法成立。

溶栓膠囊由地龍等提取而成,其功能為清熱定驚,活血通絡(luò)[14]。文獻(xiàn)報(bào)道該藥可改善缺血引起的組織損傷,促進(jìn)其梗死病灶的修復(fù)[15],并能增加腦內(nèi)血流量和減少其血管阻力[16],改善微循環(huán),對(duì)小兒腦癱癥狀有明顯療效[17],證實(shí)其有改善患兒運(yùn)動(dòng)能力,語(yǔ)言能力,生活自理能力,溝通能力以及社交能力,同時(shí)促進(jìn)患兒腦部發(fā)育,提高其智力水平的作用[18]。本研究灌胃給藥4周,觀察到溶栓膠囊可明顯改善肌力喪失及學(xué)習(xí)記憶能力障礙,保護(hù)HIE小鼠神經(jīng)損傷,其機(jī)制可能與增加腦缺血缺氧耐受和腦儲(chǔ)備能力有關(guān)。

[1]Salem N,Jr.,Litman B,Kim HY,et al.Mechanisms of action docosahexaenoic acid in the nervous system[J].Lipids,2001,36:945-959.

[2]Ten VS,Sosunov SA,Mazer SP,et al.C1q-deficiency is neuroprotective against hypoxic-ischemic brain injury in neonatal mice[J].Stroke,2005,36(10):2244-2250.

[3]Rosenbaum JL,Almli CR,Yundt KD,et al.Higher neonatal cerebral blood flow correlates with worse childhood neurologic outcome[J].Neurology,1997,49(4):1035-1041.

[4]Yonekura I,Kawahara N,Nakatomi H,et al.A model of global cerebral ischemia in C57 BL/6 mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2004,24(2):151-158.

[5]雷永彩.新生兒缺血缺氧性腦病的觀察護(hù)理[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2017,17(73):220-223.

[6]劉學(xué)敏.新生兒缺血缺氧性腦病的護(hù)理分析與對(duì)策[J].文摘版:醫(yī)藥衛(wèi)生,2016,8(2):124-124.

[7]Zaheer S,Beg M,Rizvi I,et al.Correlation between serum neuron specific enolase and functional neurological outcome in patients of acute ischemic stroke[J].Ann Indian Acad Neurol,2013,16(4):504-508.

[8]van Munster BC,Korse CM,de Rooij SE,et al.Markers of cerebral damage during delirium in elderly patients with hip fracture[J].BMC Neurol,2009,9:21.

[9]王衛(wèi)平,毛萌,李廷玉,等.兒科學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:107.

[10]潘惠妮,吳郁麗,張成,等.神經(jīng)元特異性烯醇化酶與新生兒缺氧缺血性腦病及腦性癱瘓的相關(guān)性[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(18):97-100.

[11]劉正清,馬志健,劉裕民.微管相關(guān)蛋白2與神經(jīng)元可塑性調(diào)節(jié)[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2003,13(9):51-54.

[12]張擁波,羅勇,董為偉.Caspase-3在腦缺血神經(jīng)元損傷中的作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊(cè),2000,8(2):79-81.

[13]Tanabe H,Eguchi Y,Shimizu S,et al .Death2signalling cascade in mouse cerebellar granule neurons.Eur J Neurosci,1998,10(4):1403-1411.

[14]馮玲玲,馬金保.溶栓膠囊的研制及臨床應(yīng)用[J].中草藥,1997,28(9):552-553.

[15]董閩田,管興志,匡培梓,等.溶栓膠囊對(duì)單側(cè)顳葉皮質(zhì)腦梗死大鼠空間認(rèn)知能力的改善[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2002,15(3):173-174.

[16]殷書(shū)梅,儲(chǔ)益平,吳鵬.地龍活性提取物的主要藥效學(xué)試驗(yàn)[J].中草藥,2002,33(10):926-928.

[17]龍純,蘇小波,周訓(xùn),等.溶栓膠囊配合引導(dǎo)式教育在腦癱患兒的臨床運(yùn)用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,9(8):28-29.

[18]謝麗華,全雪花,邵小猛,等.溶栓膠囊聯(lián)合針刺、康復(fù)訓(xùn)練對(duì)腦癱患兒運(yùn)動(dòng)功能和語(yǔ)言功能的影響[J].河北醫(yī)藥,2017,39(10):1499-1501.