孟紅旭 姚明江 任鈞國 劉建勛

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所,中藥藥理北京市重點實驗室，北京,100091)

延胡索又名元胡、玄胡索等，為罌粟科紫堇屬植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)的干燥塊莖，具有活血、行氣、鎮(zhèn)痛等功用，用于胸脅、脘腹疼痛、經閉痛經、產后瘀阻等，現在臨床主要集中用于心律失常、冠心病心絞痛、氣滯血瘀諸痛[1-4]。目前認為延胡索主要活性部位分是延胡索堿，主要分為叔胺堿和季胺堿。研究報道叔胺堿和季胺堿房性早搏、交界性早搏具有較好的治療作用，并發(fā)現叔胺堿與奎尼丁對心電圖的影響頗為相似，而季胺堿能夠產生與乙胺碘呋酮相似的作用，這表明這2種生物堿在抗心律失常方面具有不同的作用特點，雖然后續(xù)的研究發(fā)現延胡索堿的一些單體化合物對心肌細胞的動作電位和鉀通道產生一些效應，但是延胡索堿的抗心律失常機制仍不清楚[5-6]，本研究通過觀察叔胺堿和季胺堿對豚鼠心肌細胞動作電位和HERG通道的影響從對離子通道角度探討叔胺堿和季胺堿的作用機制和作用特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年豚鼠(300 g)，由北京斯克貝實驗動物科技有限公司提供(合格證號：SCXK(京)2011-0004)。

1.1.2 藥物 季胺堿(中國科學院大連化物所饋贈,批號：20140821，總堿含量>90%)和叔胺堿(中國科學院大連化物所饋贈,批號：20140821總堿含量>60%)和特非那定(大連美侖生物技術有限公司，批號：S0425A)。

1.1.3 試劑與儀器 無鈣臺式液(mmol/L)：NaCl140，KCl 5.4，NaH2PO4 0.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(用NaOH調節(jié)至PH7.4)；KB液(mmol/L)：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(用KOH調節(jié)至PH7.4)；測定動作電位電極內液(mmol/L)：KCl 140，Na2ATP 4，MgCl21，EGTA 5，HEPES 10，Glucose 10(用KOH調節(jié)至pH 7.2)；測定HERG電流電極內液(mmol/L)：KCl 130，MgCl21，MgATP 5，EGTA 5，HEPES 10，glucose 10(用KOH調節(jié)至pH 7.2)，除指定藥品外全部從Sigma-Aldrich中國公司購入。(PULL-100美國)和膜片鉗放大器(HEKA EPC10德國)。

1.1.4 豚鼠單個心室肌細胞的分離 豚鼠用20%烏拉坦10 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速開腹取下心臟，在0 ℃無鈣臺式液的冰水混合液中去除脂肪以及多余組織，經主動脈逆行插管將心臟置于Langendorff灌流裝置。用無鈣臺式液灌流心臟3～5 min，再用含酶(膠原酶Ⅰ0.3 g/L+蛋白酶E 0.1 g/L+牛血清白蛋白0.8 g/L)無鈣臺式液灌流1 min后，改成酶液環(huán)灌流4 min。剪下心室肌，在KB液中剪碎并輕輕吹打，用200目篩網過濾，貯存于4 ℃冰箱中待用。整個過程保持流入心臟的液體溫度為37 ℃，同時保證離體心臟的暴露環(huán)境溫度在22 ℃以上，各液體始終通以99.5%醫(yī)用氧氣。

1.2 方法

1.2.1 HERG-HEK293細胞的培養(yǎng) 將轉染并穩(wěn)定表達人源心肌HERG離子通道的HEK293細胞(河北醫(yī)科大學藥理室提供)復蘇后接種于玻璃片上置于培養(yǎng)皿中，采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。HERG通道蛋白由GFP熒光蛋白標記，在藍色熒光激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，誘導出的電流能夠被特非那定(1 μmol/L)阻斷，證明為穩(wěn)定表達HERG離子通道。見圖3。

1.2.2 全細胞膜片鉗記錄 取一滴心室肌細胞懸液，置于倒置顯微鏡實驗平臺上的1 mL浴槽內，靜置5 min使細胞充分貼附于浴槽底部，然后用臺式液進行灌流，流速為2 mL/min，5 min后選擇邊緣整齊、橫紋清晰、表面光潔、靜止的桿狀心室肌細胞進行實驗。將HEK293細胞培養(yǎng)玻璃片直接置于細胞槽內，然后用臺式液(CaCl22.0 mmol/L)進行灌流，選擇三角形，折光性好的細胞進行實驗。操作微操使玻璃微電極接觸細胞膜負壓形成高阻抗封接(兆歐封接)，吸破細胞膜形成全細胞記錄狀態(tài)。在PULSE軟件控制下，數字脈沖經D/A轉換成模擬電壓或電流信號，再經膜片鉗放大器放大，通過Ag-AgCl電極導入細胞，產生的電流或電壓信號經膜片鉗放大器輸出，再經A/D轉換，由計算機采集整理數據。實驗在22 ℃室溫下進行。

2 結果

2.1 季胺堿和叔胺堿對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響 膜片鉗放大器在電流鉗模式下記錄單個心室肌細胞動作電位，給予細胞刺激電流(強度400～900 pA，持續(xù)10～35 ms)引發(fā)動作電位。給予叔胺堿(3、10 mg/L)后，動作電位未見明顯變化(n=3)(圖1A),給予叔胺堿(30、100 mg/L)可見動作電位時程明顯延長，洗脫后部分恢復，靜息電位和動作電位幅度未見明顯變化(圖1B)。測定ADP90(復極至90%動作電位時程)，將叔胺堿與灌流臺式液(對照)指標進行比較，計算ADP90延長率(ADP90叔-ADP90臺/ADP90臺)，叔胺堿(30、100 mg/L)ADP90的延長率分別為(10.8±9.2)%(n=5)、(35.3±22.3)%(n=5)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明叔胺堿延長動作電位時程具有濃度依賴性。給予季胺堿(1、3 mg/L)后，動作電位時程出現縮短，靜息電位變深，動作電位幅度未見明顯變化(n=4)(圖2C);靜息電位由(-68.2±10.5)mV變?yōu)?-71.1±11.1)mV(n=4,P<0.05)和(81.5±13.8)mV(n=4,P>0.05)。給予10 mg/L季胺堿(n=2)后對動作電位時程未見明顯改變，給予季胺堿(30、100 mg/L)可見動作電位時程明顯延長，洗脫后部分恢復，靜息電位和動作電位振幅未見明顯變化(圖2B)，測定ADP90，將季胺堿與灌流臺式液(對照)指標進行比較，計算縮短率(ADP90臺-ADP90季/ADP90臺)，30 mg/L和100 mg/L季胺堿縮減率分別為(5.4±2.5)%(n=4)，(7.6±6.2)%(n=4),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 季胺堿和叔胺堿對豚鼠心室肌細胞動作電位的影響

注：A.叔胺堿(3、10 mg/L);B. 叔胺堿(30、100 mg/L);C. 季胺堿(1、3 mg/L);D. 季胺堿(30、100 mg/L)

2.2 季胺堿和叔胺堿對HERG電流的影響 轉染HERG通道的HEK293細胞，HERG通道蛋白由GFP熒光蛋白標記，在藍色熒光激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，給予單刺激電壓誘導出HERG電流，可被特非那定(1 μmol/L)所阻斷。見圖2。給予叔胺堿(3～300 mg/L)，HERG通道尾電流隨濃度增加變化逐漸減弱，洗脫后部分恢復。一例不同濃度的叔胺堿對同一個細胞HERG通道電流的作用。見圖3。將尾電流峰值作為觀察指標，將給藥后該指標與灌流臺式液(對照)指標進行比較，計算抑制率(I臺-I藥/I臺),其中叔胺堿(3、10、30、100、300mg/L)抑制率分別為：(6.4±5.3)%(n=4)、(15.1±8.7)%(n=4)、(31.6±10.2)%(n=7)、(80.2±10.3)%(n=6)、100%(n=2),采用logistic公式y(tǒng)=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)p]，A1、A2分別為最小和最大抑制率，x0為IC50，p為斜率)進行擬合，繪制量效曲線(圖3)，計算出叔胺堿的IC50為(55±7.2)mg/L。給予叔胺堿(1、3 mg/L)灌流，HERG通道尾電流出現增強，洗脫后恢復，圖4顯示1例叔胺堿(1、3 mg/L)對同一個細胞HERG通道電流的作用。將尾電流峰值作為觀察指標，計算增強率(I藥-I臺/I臺),其中1 mg/L和3 mg/L季胺堿增強率分別為：(28.2±6.9)%(n=4)、(40.6±11.3)%(n=4)。給予叔胺堿(30、100、300 mg/L)灌流，HERG通道尾電流出現抑制，洗脫后恢復，圖4顯示一例叔胺堿(10、30、100 mg/L)對同一個細胞HERG通道電流的作用。30 、100 、300 mg/L季胺堿抑制率分別為：(39.4±6.7)%(n=4)、(84.7±0.7)%(n=2)、100%(n=2)。10 mg/L季胺堿呈現出對HERG通道電流的雙向作用，2個細胞表現為增強效應，2個細胞表現為抑制效應。

圖2 穩(wěn)定轉染HERG通道的HEK293細胞和特非那定的抑制作用

圖3 叔胺堿對HERG通道電流的作用

圖4 季胺堿對HERG通道電流的作用

3 討論

現代藥物化學和藥理學實驗表明，延胡索中的主要活性成分為叔胺和季銨型兩類生物堿，其中叔胺堿含量約為0.65%，季銨堿含量約為0.3%[7]。這2類成分在結構、溶解性和藥理作用上也有著很大的不同：以延胡索甲素，乙素，丙素，丁素等為代表的叔胺型生物堿幾乎不溶于水，往往具有良好的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用，是延胡索用于傳統(tǒng)止痛治療的主要活性成分，而延胡索在抗心肌缺血、減少心肌氧耗等方面的顯著作用，主要是緣于而水溶性較好的季銨堿，其主要包括小檗堿型的黃連堿、小檗堿、脫氫紫堇堿、非洲防己胺等[8-10]。早在上世紀八十年代馬勝興、陳可冀等發(fā)現延胡索堿具有治療快速性心律失常的作用，而且叔胺堿和季銨堿對心電圖產生不同影響：叔胺堿能夠引起心電圖P、QRS波增寬和P-R、Q-T間期延長，與奎尼丁對心電圖的影響頗為相似，而季胺堿具有與乙胺碘呋酮相似的延長Q-T間期、使T波變形、心率減慢和擴張血管及降低血壓等作用，在抗烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常治療作用的實驗中，延胡索總堿中水不溶性(相當于叔胺堿)部分作用更為顯著，表明叔胺堿和季胺堿在快速性心律失常方面具有不同的作用機制和作用特點,隨后的研究發(fā)現延胡索堿的一些主要單體化合物可以抑制鉀離子通道和鈣離子通道，延長動作電位時程和有效不應期，降低自律性等作用[5]。本研究從動作電位和離子通道角度探討叔胺堿和季胺堿的抗心律失常方面不同的作用機制和作用特點，結果發(fā)現高濃度的叔胺堿和季胺堿均可以延長豚鼠心室肌細胞的動作電位時程(APD)，這可能是2種生物堿皆可延長心電圖Q-T間期的原因，但是在低濃度2種生物堿的作用相反，叔胺堿對APD無明顯影響，而季胺堿可明顯縮短APD，季胺堿的效應雙相性可能是其治療快速型心律失常方面弱于叔胺堿的原因。

目前認為心肌細胞動作電位形成與維持是心肌細胞的特異性或非特異性離子通道在動作電位各期呈現不同開閉的結果，心臟快速延遲整流鉀電流(IKr)是心肌細胞動作電位3期復極的主要電流，對IKr通道的抑制是其延長動作電位時程的機制之一，但是天然表達的IKr電流幅值較小，易受其他通道電流的干擾。HERG基因編碼IKr的α亞單位，通過利用轉染并穩(wěn)定表達HERG通道的人胚腎細胞株(HEK-293)建立的外源性表達系統(tǒng)可以有效解決這些問題[11-13]。本研究采用這種穩(wěn)定轉染的細胞觀察了叔胺堿和季胺堿對HERG通道的影響，結果顯示高濃度的叔胺堿和季胺堿均可以抑制HERG通道電流，低濃度的叔胺堿可輕度抑制HERG通道電流，而低濃度的季胺堿與之相反，興奮HERG通道電流，也呈現明顯的雙相性。叔胺堿和季胺堿對HERG通道的影響與對心肌細胞動作電位的作用相一致，表明這2種生物堿對動作電位的作用主要是通過抑制IKr產生的，也進一步說明延胡索堿的抗快速心律失常的靶點之一可能是IKr的α亞單位。一些文獻報道了延胡索堿的一些單體化合物也對心肌細胞的L-型鈣通道具有抑制效應[14]，說明延胡索堿的抗快速心律失常也許是多種特異性或者非特異離子通道共同作用的結果，后續(xù)的研究將進一步觀察其他類型離子通道的作用。另一方面，阻斷IKr電流可導致心電圖QT間期延長、T波和U波異常等，易發(fā)生室性心律失常，尤其是尖端扭轉型室性心動過速(TdP)，可致猝死，體外IKr/HERG通道檢測目前已成為心血管安全性藥理試驗的重要部分,近年中藥注射劑頻發(fā)不良反應事件，中藥注射劑對QT間期的影響缺乏風險評估[15]。由于通過口服等方式攝入體內的延胡索堿含量較低，所以心臟毒性并不明顯，若制成延胡索堿注射劑時，叔胺堿的對HERG電流抑制的IC50已經達到55 mg/L，有必要對其心臟毒性進行進一步研究。

總之，本研究發(fā)現了心臟快速延遲整流鉀電流是延胡索堿的抗心律失常機制主要靶點之一，并且延胡索堿的2種生物堿叔胺堿和季胺堿對這種離子通道的作用存在差異。

[1]施婷婷,王建新,李希.延胡索總生物堿類有效部位的研究進展[J].中藥與臨床，2015，6(2)：110-113.

[2]楊波,紀宏宇,鄭東友,等.中藥延胡索的炮制工藝和藥理作用的研究進展[J].藥學實踐雜志，2017，35(2):112-115.

[3]何四琴,李艷.復方延胡索湯劑聯(lián)合美托洛爾治療老年缺血性室性心律失常的臨床研究[J].醫(yī)藥，2016(11):00132-00132.

[4]王鳳,杜文婷,章怡祎,等.辨病癥論治心律失常概況與展望[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21(13):217-221.

[5]張萍,徐鳳芹,馬曉昌,等.延胡索堿治療快速性心律失常的研究進展[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2012,32(5):713-716.

[6]賀凱,高建莉,趙光樹.延胡索化學成分、藥理作用及質量控制研究進展[J].中草藥，2007,38(12)：1909-1912.

[7]趙麗沙,董宇,壽旦.延胡索生物堿類化學成分及質量控制研究進展[J].中華中醫(yī)藥學刊，2017，35(2):299-302.

[8]趙翡翠,趙曉琴,李永和.醋制延胡索中延胡索乙素含量及鎮(zhèn)痛作用的對比研究[J].新疆中醫(yī)藥,2007,25(2):34-36.

[9]楊堃,李真真,潘麗,等.延胡索總生物堿對異丙腎上腺素誘導的心肌梗死大鼠的心肌保護作用[J].中國臨床研究,2016,29(8):1057-1061.

[10]張萍,王海云,蘇博,等.延胡索提取物對AMI大鼠模型心肌梗死面積及Na～+-K～+-ATPase、Ca～(2+)-ATPase活性的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2017,15(4):410-415.

[11]張建成,林琨,魏芝雄,等.大蒜素對HEK293細胞HERG電流的阻滯作用[J].南方醫(yī)科大學學報,2015，35(8):1128-1132.

[12]夏靜,彭雙清.應用膜片鉗技術檢測藥物對HERG通道抑制作用的實驗過程及要點[J].軍事醫(yī)學，2015，39(11):884-886.

[13]方培亮,廉姜芳.HERG鉀通道蛋白質轉運異常和功能恢復與LQTS的研究進展[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2016,33(1):101-104.

[14]姚嵐,方芳.作用于心肌細胞離子通道的抗心律失常中藥硏究進展[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2017,15(9):1057-1059.

[15]杜群群,陳曉南,祝婕,等.抗心律失常復方中藥穩(wěn)心顆粒的心臟安全性再評價[J].中南藥學，2016，14(6):567-571.